高謀 徐如祥 王文佳 董勤 丁柏勻 姚慧 楊志軍

顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）損傷性疾病，其流行病學(xué)特點(diǎn)呈現(xiàn)為高發(fā)病率和高致死致殘率，嚴(yán)重危害人類生命健康[1]。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可發(fā)揮保護(hù)受損傷的神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)與再生，減輕TBI后繼發(fā)性腦損傷等多種作用[2,3]。此外，TBI后腦組織內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)可受多種因素影響，例如，TBI既可激活內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，也可因破壞組織細(xì)胞而減少神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的合成與分泌[3,4]。由此可見(jiàn)，有效提高TBI后腦組織內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)水平仍是促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的研究重點(diǎn)[3,4]。筆者曾報(bào)道誘導(dǎo)型神經(jīng)干細(xì)胞（induced neural stem cells，iNSCs） 移植可促進(jìn) TBI動(dòng)物神經(jīng)功能恢復(fù)，并在iNSCs體外培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其可表達(dá)多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell-line derived neurotrophic factor，GDNF）[5,6]。然而，iNSCs移植物能否在 TBI動(dòng)物腦組織中表達(dá)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用目前尚不明確。為此，本研究用自由落體腦打擊裝置制備C57BL/6小鼠TBI模型，并將C57BL/6小鼠iNSCs經(jīng)立體定向注射到TBI小鼠腦內(nèi)，于移植后7 d處死動(dòng)物。取腦組織mRNA行逆轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription quantitative realtime polymerase chain reaction，RT-qPCR） 檢測(cè) Bdnf和Gdnf基因轉(zhuǎn)錄水平。隨后，取腦組織蛋白行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）檢測(cè)BDNF和GDNF蛋白表達(dá)量。在明確各組TBI動(dòng)物腦組織中BDNF和GDNF表達(dá)量的基礎(chǔ)上，選取iNSCs移植組動(dòng)物腦組織行免疫熒光染色，并用激光共聚焦顯微鏡觀察iNSCs移植物分泌BDNF和GDNF等情況，以探討經(jīng)腦立體定向移植iNSCs對(duì)TBI后神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性C57BL/6小鼠30只，8～10周齡，體質(zhì)量24～30 g，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（無(wú)特定病原體級(jí)）均購(gòu)自北京維通利華公司。

二、主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和MultiskanTMMK3酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國(guó)），超凈工作臺(tái)（ESCO公司，美國(guó)），ABI ViiA7TM實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀（Applied Biosystems公司，美國(guó)），倒置相差顯微鏡、CM1950冰凍切片機(jī)、TCS SP5Ⅱ激光共聚焦顯微鏡和DM3000熒光顯微鏡（Leica公司，德國(guó)）。

試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、B27、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、Accutase酶、左旋谷酰胺和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（Invitrogen 公司，美國(guó)），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和RIPA試劑（Sigma公司，美國(guó)），QuantScript RT試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，SYBR Green Master Mix試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]，小鼠 BDNF ELISA 試劑盒（Promega公司，美國(guó)），小鼠GDNF ELISA試劑盒（Santa Cruz Biotechnology公司，美國(guó)），BDNF 抗體（工作濃度：5 μL/mL）、GDNF 抗體 （工作濃度：5 μg/mL）（Abcam 公司，美國(guó)），Alexa Fluor?555標(biāo)記驢抗兔IgG抗體（工作濃度：2 μg/mL）（Life Tech 公司，美國(guó)），4’,6-二脒基-2-苯 基 吲 哚 （4’，6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI）（SouthernBiotech 公司，美國(guó)）。

三、C57BL/6小鼠iNSCs體外培養(yǎng)

C57BL/6小鼠 iNSCs用含 2%B27、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、0.05%BSA 和 2 mmol/L 左旋谷酰胺的DMEM/F12與Neurobasal等體積混合培養(yǎng)基培養(yǎng)。

四、C57BL/6小鼠TBI模型制備和iNSCs移植

用異氟烷氣體麻醉劑麻醉小鼠，并將其固定于腦立體定向儀上，備皮消毒，鋪無(wú)菌洞巾，切開(kāi)皮膚，暴露前囟，以lambda縫向喙側(cè)2.0 mm、中線偏右側(cè)2.0 mm為撞擊點(diǎn)。用自由落體腦打擊裝置，撞針直徑3.0 mm，制備TBI模型。設(shè)置假手術(shù)（sham）組（9只），僅切開(kāi)頭皮，不實(shí)施撞擊。于傷后1 h對(duì)TBI小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分（neurological severity scores，NSS），將 NSS 為 4～8 分者（21 只）納入 TBI組，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為：iNSCs移植組（12只）和PBS處理組（9只）。于TBI后12 h，再次麻醉小鼠，并將其固定于腦立體定向儀上，消毒鋪巾，暴露前囟，以lambda縫向喙側(cè)5.0 mm，中線偏右側(cè)1.0 mm，硬膜下2.0 mm為注射位點(diǎn)，用25 μL 22 s微量進(jìn)樣器以0.5 μL/min的速度注射5 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞總量為1×106個(gè)，結(jié)束后留針5 min，縫合頭皮。PBS處理組以同樣方式注射等體積PBS。

五、RT-qPCR

細(xì)胞移植后7 d采用隨機(jī)數(shù)字表法從各組中選取3只動(dòng)物進(jìn)行處死，取新鮮腦組織，稱量后，用液氮研磨法提取總RNA。用QuantScript RT試劑盒，按照說(shuō)明書步驟合成cDNA，并保存于-80℃冰箱內(nèi)。用SYBR Green Master Mix試劑盒，按照說(shuō)明書步驟以cDNA作為模板，用ABI ViiA7TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)各組動(dòng)物腦組織中Bdnf和Gdnf基因轉(zhuǎn)錄水平，以PBS處理組為對(duì)照計(jì)算各組間mRNA的表達(dá)倍數(shù)。

六、ELISA

細(xì)胞移植后7 d采用隨機(jī)數(shù)字表法從各組中選取6只動(dòng)物進(jìn)行處死，取新鮮腦組織，稱質(zhì)量后，用RIPA試劑提取總蛋白，分裝后保存于-80℃冰箱。用小鼠BDNF ELISA試劑盒和小鼠GDNF ELISA試劑盒，按照說(shuō)明書步驟操作，用MultiskanTMMK3酶標(biāo)儀測(cè)量蛋白樣品的光密度，用ELISA Calc V軟件計(jì)算各組動(dòng)物腦組織中BDNF和GDNF蛋白表達(dá)水平。

七、腦組織冰凍切片、病理染色和免疫熒光染色

細(xì)胞移植后7 d采用隨機(jī)數(shù)字表法從iNSCs移植組中選取3只動(dòng)物進(jìn)行處死，灌注固定后取出大腦，并作大腦冠狀面連續(xù)冰凍切片，切片厚度為10 μm。用蘇木素-伊紅染色觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)特征。根據(jù)病理染色結(jié)果挑選腦組織切片進(jìn)行免疫熒光染色，用10%BSA/0.3%TritonX-100封閉1 h后，分別加入BDNF抗體（工作濃度：5 μL/mL）和GDNF抗體（工作濃度：5 μg/mL）在4℃孵育過(guò)夜。 用 PBS漂洗后，分別加入Alexa Fluor?555標(biāo)記驢抗兔IgG抗體（工作濃度：2 μg/mL），室溫避光孵育 2 h。 用DAPI染細(xì)胞核，封片后，用激光共聚焦顯微鏡觀察iNSCs移植物表達(dá)BDNF和GDNF等情況。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠腦組織中Bdnf和Gdnf基因轉(zhuǎn)錄水平以及BDNF和GDNF蛋白表達(dá)水平以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、INSCs移植物上調(diào)TBI小鼠腦組織中Bdnf和Gdnf基因轉(zhuǎn)錄水平

在TBI后7 d，相比sham組，TBI小鼠腦組織中Bdnf和Gdnf基因轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，與 PBS 處理組相比，iNSCs移植組TBI小鼠腦組織中Bdnf和Gdnf基因轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，2組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。具體信息見(jiàn)表1。

表1 顱腦創(chuàng)傷7 d后的各組小鼠腦組織中Bdnf和Gdnf mRNA 表達(dá)倍數(shù)（Mean±SD）

二、INSCs移植物增加TBI小鼠腦組織中BDNF和GDNF蛋白表達(dá)水平

在TBI后7 d，相比sham組，TBI小鼠腦組織中BDNF和GDNF蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，與PBS處理組相比，iNSCs移植組TBI小鼠腦組織中BDNF和GDNF蛋白表達(dá)水平明顯升高，2組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。具體信息見(jiàn)表2。

表2 顱腦創(chuàng)傷7 d后的各組小鼠腦組織中BDNF和GDNF 蛋白表達(dá)水平（Mean±SD，pg/mg）

三、INSCs移植物在 TBI小鼠腦組織中表達(dá)BDNF和GDNF

在TBI后7 d，iNSCs移植組TBI小鼠腦組織中可見(jiàn)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的iNSCs移植物從細(xì)胞注射位點(diǎn)遷移到達(dá)腦損傷區(qū)。此外，在激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)這些到達(dá)腦損傷區(qū)呈GFP陽(yáng)性的iNSCs移植物表達(dá)BDNF和 GDNF（圖 1）。

討 論

TBI后神經(jīng)功能的恢復(fù)程度與患者預(yù)后密切相關(guān)，由于影響CNS損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的因素較多，且涉及復(fù)雜的病理生理過(guò)程，目前尚缺乏綜合有效的治療手段，因而探索促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的療法仍是臨床與基礎(chǔ)研究的重要課題[7-9]。既往認(rèn)為干細(xì)胞移植在CNS損傷性疾病的治療中可發(fā)揮細(xì)胞替代作用，從而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[10,11]。近年來(lái)隨著研究深入，越來(lái)越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞不僅可發(fā)揮細(xì)胞替代作用，也可通過(guò)合成分泌多種物質(zhì)影響和改善微環(huán)境，為組織細(xì)胞的修復(fù)與再生創(chuàng)造有利條件[12-15]。筆者曾報(bào)道iNSCs移植物可促進(jìn)TBI動(dòng)物神經(jīng)功能恢復(fù)，行免疫熒光染色可見(jiàn)iNSCs移植物從細(xì)胞注射位點(diǎn)逐漸向腦損傷區(qū)遷移，然而由iNSCs分化為成熟的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較少，由此推測(cè)iNSCs發(fā)揮細(xì)胞替代作用并不能完全解釋TBI后神經(jīng)功能恢復(fù)[5,16]。筆者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，iNSCs移植物可調(diào)控TBI后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)，使其由促進(jìn)炎癥反應(yīng)類型向促進(jìn)組織細(xì)胞修復(fù)類型轉(zhuǎn)變；此外iNSCs移植物可抑制TBI后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，這些均為神經(jīng)細(xì)胞的存活創(chuàng)造了良好的條件[5,16]。除此之外，筆者曾報(bào)道iNSCs在體外培養(yǎng)過(guò)程中可表達(dá)多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如BDNF和GDNF[6]。前已述及，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可通過(guò)多種途徑發(fā)揮保護(hù)受損傷的神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)與再生，減輕TBI后繼發(fā)性腦損傷等多種作用，由此可見(jiàn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在促進(jìn)TBI后神經(jīng)功能恢復(fù)中具有良好的治療效果[3,4]。然而，iNSCs移植物是否可在TBI后腦組織中合成分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用有待闡明。為此，本課題組探討了iNSCs移植對(duì)TBI后神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CNS損傷后，即在TBI小鼠腦組織中，Bdnf和 Gdnf基因轉(zhuǎn)錄水平以及BDNF和GDNF蛋白表達(dá)水平均明顯降低。這與既往文獻(xiàn)報(bào)道，TBI破壞組織細(xì)胞可減少神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的合成與分泌相符合[3,4]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)立體定向移植iNSCs可上調(diào)TBI后腦組織中Bdnf和Gdnf基因轉(zhuǎn)錄水平以及BDNF和GDNF蛋白表達(dá)水平。然而，與sham組相比，iNSCs移植組Bdnf和Gdnf基因轉(zhuǎn)錄水平以及BDNF和GDNF蛋白表達(dá)水平仍明顯降低。說(shuō)明iNSCs移植物可在一定程度上彌補(bǔ)TBI后神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌的不足，然而其是通過(guò)自身合成分泌，還是促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)有待進(jìn)一步闡明。

圖1 顱腦創(chuàng)傷7 d后的iNSCs移植組小鼠腦組織免疫熒光染色檢測(cè)（×400）

為探討經(jīng)立體定向移植iNSCs上調(diào)TBI后腦組織中Bdnf和Gdnf基因轉(zhuǎn)錄水平以及BDNF和GDNF蛋白表達(dá)水平的作用機(jī)制，本研究行免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：GFP標(biāo)記的iNSCs移植物從細(xì)胞注射位點(diǎn)向腦損傷區(qū)遷移聚集，這與之前研究報(bào)道相符。此外，腦組織中BDNF和GDNF蛋白在iNSCs移植物分布區(qū)呈局部聚集現(xiàn)象，并且BDNF和GDNF蛋白在移植的GFP陽(yáng)性iNSCs內(nèi)具有共定位的關(guān)系。說(shuō)明iNSCs移植物可通過(guò)合成BDNF和GDNF在一定程度上彌補(bǔ)TBI后神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌的不足。結(jié)合iNSCs移植組BDNF和GDNF表達(dá)水平介于PBS處理組和sham組之間，以及腦組織中iNSCs移植物與BDNF和GDNF蛋白的分布特點(diǎn)，可推測(cè)iNSCs移植物主要是通過(guò)自身合成分泌BDNF和GDNF為主，目前尚缺乏證據(jù)顯示iNSCs移植物可促進(jìn)內(nèi)源性BDNF和GDNF表達(dá)。

綜上所述，經(jīng)腦立體定向移植iNSCs可在TBI后腦組織中合成分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF和GDNF，發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。本研究是基于前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)iNSCs在體外培養(yǎng)時(shí)可分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，進(jìn)而在TBI動(dòng)物腦組織中探討iNSCs移植物發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用及相關(guān)機(jī)制。通過(guò)分子生物學(xué)及形態(tài)學(xué)等實(shí)驗(yàn)研究，筆者發(fā)現(xiàn)iNSCs移植物主要以自身合成分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF和GDNF增加TBI后神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)量，這為分析iNSCs移植療法促進(jìn)CNS損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)提供了新的參考依據(jù)。后續(xù)研究筆者將重點(diǎn)關(guān)注iNSCs移植物自身合成分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是否受移植微環(huán)境影響以及iNSCs移植物能否影響內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)，期望通過(guò)這一系列研究為體外重編程來(lái)源的iNSCs移植治療CNS損傷性疾病打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。