劉元 周俊 崔曉利 雷佳媛 黨麗云

耐藥結核病尤其是耐多藥結核病(MDR-TB)的出現(xiàn)，在許多國家已經成為重大的公共衛(wèi)生問題和全球結核病有效控制的障礙。據(jù)WHO估計，2017年全球新發(fā)利福平耐藥結核病(RR-TB)患者55.8萬例，其中82%為MDR-TB，我國結核病患者對利福平的耐藥率依然高居全球第二[1]。目前，MTB的表型藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)由于耗費時間長，操作復雜，已難以滿足耐藥結核病的診療需要，而分子生物學藥敏試驗方法以其簡便、快速的優(yōu)點已成為結核病快速診斷的重要手段[2]?；蛐酒夹g和線性探針技術(GenoType MTBDRplus)是兩種比較常用的分子生物學藥敏試驗方法[3-4]?；蛐酒夹g可以檢測耐藥基因突變位點，避免檢出與耐藥無關位點突變而導致的假陰性[2]；線性探針技術是WTO推薦的涂陽肺結核患者的耐藥檢測技術。兩種方法檢測耐藥基因的覆蓋位點各有不同。目前，雖然有文獻分別就兩種方法的檢測效能進行了評價[3-4]，但對兩種方法的對比研究較少。筆者通過對454例涂陽肺結核患者痰標本的檢測，分析兩種方法的異同。

資料和方法

一、研究對象

選取西安市胸科醫(yī)院2017年4月至2018年8月確診并住院治療的493例涂陽肺結核患者作為研究對象，其中，初治患者386例，復治患者107例。收集研究對象痰標本，痰標本量均不少于2 ml。每例患者用同一份痰標本分別進行基因芯片檢測、線性探針檢測和BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960液體培養(yǎng)”)，同時對培養(yǎng)陽性且鑒定為MTB的臨床分離株進行MGIT 960液體藥敏試驗。

二、試驗方法

1.儀器與試劑：(1)儀器：PCR擴增儀、芯片雜交儀和微陣芯片掃描讀片儀(北京博奧生物有限公司)；GT-Blot 48雜交儀(法國生物梅里埃公司)；MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)(美國BD公司)。(2)試劑：晶芯結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒(北京博奧生物有限公司)；GenoType MTBDRplus ver 1.0試劑盒(法國生物梅里埃公司)；MGIT 960液體培養(yǎng)管及分枝桿菌藥敏試驗檢測試劑盒(美國BD公司)；MPT64快速抗原檢測試劑(杭州創(chuàng)新生物檢控技術有限公司)。

2.標本前處理：采用中和離心法去污染處理，涂陽痰標本采用N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-NaOH消化液處理15 min，加磷酸鹽緩沖液(PBS)至40 ml，在4 ℃下3000×g離心20 min，棄上清液，沉淀加入1.5 ml PBS振蕩重懸。重懸后的痰標本各取0.5 ml分別進行MGIT 960液體培養(yǎng)、基因芯片檢測和線性探針檢測。

3.MGIT 960液體培養(yǎng)：參照《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》及MGIT 960液體培養(yǎng)操作手冊進行標準化操作。取0.5 ml前處理后的痰標本加入MGIT 960培養(yǎng)管中，放入MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)。一旦MGIT 960培養(yǎng)管通過儀器報告呈陽性，使用痰涂片鏡檢確認陽性產物，并用MPT64快速抗原檢測試劑確認陽性產物為MTB。

4. MGIT 960液體藥敏試驗：取MTB陽性產物0.5 ml接種到含藥培養(yǎng)基上(利福平藥物濃度1 μg/ml，異煙肼藥物濃度0.1 μg/ml)。另取0.2 ml陽性產物用PBS稀釋100倍后，取0.5 ml接種到生長對照管中，放入MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)。當生長對照管中生長單位(growth unit，GU)指數(shù)達到400時(4～13 d內)，評估含藥培養(yǎng)管的GU值；含藥培養(yǎng)管的GU值<100為敏感，含藥培養(yǎng)管的GU值≥100為耐藥。

5.基因芯片法耐藥基因檢測：應用核酸提取試劑盒提取研究對象痰標本中的MTB-DNA，進一步按照晶芯結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒的說明書進行PCR擴增、芯片雜交、洗滌、甩干及結果掃描。

6.線性探針法耐藥基因檢測：采用超聲裂解法提取研究對象痰標本中的MTB-DNA。取5 μl提取后的DNA加入已準備好的45 μl擴增混合物，按照說明書的擴增程序進行擴增。擴增完成后取20 μl 擴增產物進行雜交，雜交過程包括化學變性、雜交孵育、洗滌、偶聯(lián)和顯色等。根據(jù)顯色結果進行耐藥情況的判讀。判讀標準：野生條帶均顯色且突變條帶無顯色時為敏感，野生條帶有缺失或突變條帶顯色為耐藥。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。以MGIT 960液體藥敏試驗結果為參照標準，分析基因芯片技術及線性探針技術檢測涂陽肺結核患者痰標本MTB對利福平和異煙肼耐藥性的效能，各項指標計算方法：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致性檢驗采用Kappa檢驗，Kappa值≥0.75時認為兩者一致性較好。

結 果

一、基本情況

493例研究對象痰標本經MGIT 960液體培養(yǎng)，陰性18例(3.7%)、污染6例(1.2%)、陽性469例(95.1%)；培養(yǎng)陽性的469例研究對象，經鑒定5例(1.1%)為非結核分枝桿菌感染，464例研究對象完成了表型藥敏試驗。493例研究對象痰標本經基因芯片檢測，469例具有藥敏試驗結果；經線性探針檢測，472例具有藥敏試驗結果。共有454例研究對象同時具有表型藥敏試驗、基因芯片檢測及線性探針檢測結果。

二、MTB利福平耐藥性檢測結果分析

454例涂陽肺結核患者痰標本，經MGIT 960液體藥敏試驗檢測利福平耐藥73例，耐藥率為16.1%。以MGIT 960液體藥敏試驗結果為參照標準，基因芯片法和線性探針法檢測涂陽肺結核患者痰標本MTB利福平耐藥性的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、Kappa值見表1。Kappa檢驗顯示，基因芯片法和線性探針法藥敏檢測與MGIT 960液體藥敏試驗均具有較好的一致性。

三、MTB異煙肼耐藥性檢測的結果分析

454例涂陽肺結核患者痰標本，經MGIT 960液體藥敏試驗檢測異煙肼耐藥116例，耐藥率為25.6%。以MGIT 960液體藥敏試驗結果為參照標準，基因芯片法和線性探針法檢測涂陽肺結核患者痰標本MTB異煙肼耐藥性的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、Kappa值見表2。Kappa檢驗顯示，基因芯片法和線性探針法藥敏檢測與MGIT 960液體藥敏試驗均具有較好的一致性。

表1 兩種分子生物學檢測方法以MGIT 960液體藥敏試驗結果為參照檢測涂陽肺結核患者 痰標本MTB利福平耐藥性效能

表2 兩種分子生物學檢測方法以MGIT 960液體藥敏試驗結果為參照檢測涂陽肺結核患者 痰標本MTB異煙肼耐藥性效能

四、兩種分子生物學檢測方法藥敏試驗結果比較

454例涂陽肺結核患者痰標本中，453例應用2種分子生物學檢測方法檢測MTB利福平耐藥性結果相同,符合率為99.8%。1例線性探針檢測為rpoB基因S531L突變，基因芯片檢測為敏感。445例應用2種方法檢測MTB異煙肼耐藥性結果相同，符合率為98.0%。9例不一致結果中，5例線性探針檢測為異煙肼耐藥，分別是2例katG基因S315T2突變即315(AGC→ACA)突變，3例inhA基因-8(T→C)突變，而基因芯片檢測結果均為敏感。4例基因芯片檢測為異煙肼耐藥，均為katG基因315(AGC→AAC)突變，線性探針檢測結果均為敏感(如圖1中所示的4、13、32、93號標本條帶)。

圖中右側箭頭從上至下所示分別為93、32、13、4號標本所對應的線性探針顯色條帶(此4份標本katG WT條帶顯色強度均弱于katG 條帶)。圖中上側箭頭及下側箭頭所示為本研究所關注的katG和katG WT基因顯色條帶。93、32、13、4號標本經基因芯片檢測均為katG 315 (AGC→AAC)突變，而線性探針檢測條帶顯示其katG WT 條帶并未缺失(突變條帶也未出現(xiàn))，卻有不同程度的減弱，且katG WT條帶顯色強度均弱于katG 條帶。這與katG基因真正的野生型條帶明顯不同，真正野生型katG WT條帶顯色強度均強于katG 條帶圖1 線性探針法檢測MTB異煙肼耐藥基因katG 315 (AGC→AAC)突變時的顯色條帶

討 論

基因芯片和線性探針技術是兩種能夠快速檢測MTB利福平和異煙肼耐藥性的分子生物學檢測方法，其最大優(yōu)點是檢測快速，均能在6 h內獲得藥敏結果。兩種方法雖然都是通過檢測rpoB基因、katG基因和inhA基因的突變來檢測MTB利福平和異煙肼的耐藥性，但其檢測耐藥基因的覆蓋位點各有不同。例如：對于MTB利福平耐藥性的檢測，基因芯片技術僅檢測了rpoB基因核心突變區(qū)的6個位點(531、526、516、511、533、513)的13種突變類型，而線性探針技術則通過8條分子探針覆蓋了rpoB基因核心突變區(qū)的全部27個氨基酸的81個堿基。本次研究，筆者就兩種方法檢測結果的異同進行了對比分析。

本研究中，以MGIT 960液體藥敏試驗結果為參照標準，基因芯片檢測涂陽肺結核患者痰標本中MTB利福平耐藥的敏感度和特異度分別為89.0%和96.1%；線性探針檢測的敏感度和特異度分別為90.4%和96.1%，與文獻報道的結果基本一致[5-7]。兩種方法檢測結果有1例不同，線性探針法檢測為rpoB基因S531L突變，基因芯片法檢測為敏感，可能由操作誤差所致。本次研究未發(fā)現(xiàn)rpoB基因6個常見突變位點以外的突變，表明基因芯片檢測位點以外的突變相當稀少，與歐維正等[8]報道的基因芯片檢測位點之外的位點突變僅為0.33%(9/2738)一致。與MGIT 960液體藥敏試驗結果相比，兩種方法對MTB利福平耐藥性的檢測均具有較高的一致性(Kappa值>0.75)，表明基因芯片和線性探針兩種技術都能夠勝任本地區(qū)MTB利福平耐藥性的快速檢測。

MTB對異煙肼的耐藥機制較復雜。目前研究發(fā)現(xiàn)，至少有katG、inhA、ahpC、kasA、ndh等5種不同的基因突變與異煙肼的抗藥性有關。據(jù)報導，katG315位點和inhA-15位點突變占異煙肼耐藥突變的80%以上[9-10]。由于基因芯片和線性探針檢測的分子載量有限，故兩種方法都是通過檢測katG基因和inhA基因突變實現(xiàn)對MTB異煙肼耐藥性的預測。

本研究中，以MGIT 960液體藥敏試驗結果為參照標準，基因芯片檢測涂陽肺結核患者痰標本中MTB異煙肼耐藥性的敏感度和特異度分別為80.2%和96.7%；線性探針檢測的敏感度和特異度分別為81.9%和97.0%。兩種方法的檢測效能相差不大，但兩種方法檢測結果仍有9例不同，這是由于兩種檢測方法覆蓋的突變位點不同所致，如線性探針含有katG315(AGC→ACA)、inhA-16(T→G)、inhA-8(T→C)和inhA-8(T→A)突變類型，而基因芯片有katG315(AGC→AAC)突變類型，這些突變類型在文獻[4]和[11]中均能看到，但突變頻率均不高。

在本研究中，通過對基因芯片和線性探針檢測結果的逐一對比分析，發(fā)現(xiàn)MTB在發(fā)生katG315(AGC→AAC)突變時，由于線性探針未涵蓋該突變，其檢測結果如圖1中4、13、32、93號標本條帶：野生型條帶既未缺失，突變型條帶也未出現(xiàn)，根據(jù)判讀標準應判為敏感。但筆者發(fā)現(xiàn)在這種情況下，4例標本的顯示條帶都具有共同特征：“katGWT”條帶會有不同程度的減弱，且“katGWT”條帶的顯色均弱于“katG”條帶，這與真正野生型的條帶是不同的。對比其他349條katG基因野生型的條帶，發(fā)現(xiàn) “katGWT”條帶的顯色均強于“katG”條帶(圖1中4、13、32、93號標本條帶以外的條帶)，這與許多文獻上展示的條帶帶型也是一致的[12-13]。分析發(fā)生katG315(AGC→AAC)突變時“katGWT”條帶減弱的原因，可能是與異質性耐藥有關。異質性耐藥是一種客觀存在的現(xiàn)象，即結核病患者體內通常敏感菌和耐藥菌并存[2]，在這種情況下，野生型細菌可以顯色，而突變型細菌則不能顯色，且由于不同患者突變菌所占的比例不同，所以 “katGWT”條帶的顯色強弱也不同，突變菌所占比例越高則“katGWT”條帶顯色越弱直至缺失。根據(jù)本研究的對比結果，在應用線性探針進行MTB異煙肼耐藥基因檢測時，如果出現(xiàn)“katGWT”條帶顯色弱于“katG”條帶的情況，則該患者極有可能發(fā)生katG基因的突變，建議通過測序或其他方法確認。目前，二代線性探針在臨床上已經有所應用，其和一代產品的最大差異是提高了檢測臨床標本中MTB的敏感度，可直接檢測涂陰肺結核患者的耐藥性。筆者提出的“如果出現(xiàn)‘katGWT’條帶顯色弱于‘katG’條帶則極有可能具有katG突變”是否也適用于二代產品則還有待于進一步研究。

綜上所述，基因芯片技術與線性探針技術檢測涂陽肺結核患者痰標本中MTB利福平和異煙肼耐藥性與MGIT 960液體藥敏試驗結果具有較高的一致性，由于兩類檢測方法各自有其優(yōu)缺點，有條件的實驗室可以選擇進行聯(lián)合檢測。基因芯片技術和線性探針技術具有同等的檢測效能，都可應用于本地區(qū)的結核耐藥檢測。由于兩種分子生物學方法覆蓋耐藥基因的位點不同，故檢測結果會有所差異。當線性探針的顯色結果中“katGWT”條帶的顯色弱于“katG”條帶時，該患者極有可能已經發(fā)生katG基因突變，建議再通過測序或其他方法確認。