楊翰 楊靜芬 談小文 李愛芳 崔曉利 康磊 黨麗云

近年來，雖然分子生物學(xué)藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)方法發(fā)展迅速[1-2]，但其檢測范圍并不能包含所有抗結(jié)核藥物，并且實(shí)驗儀器費(fèi)用昂貴，所以表型藥敏試驗仍然為大多數(shù)結(jié)核病實(shí)驗室應(yīng)用，以為結(jié)核病的臨床治療提供全面的藥敏信息。但在日常操作中，BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)液體藥敏試驗因標(biāo)本菌量的問題，會導(dǎo)致試驗結(jié)果有一定的報錯率；固體藥敏試驗時，人工磨菌比濁又受人為因素影響較大，這些都對藥敏試驗結(jié)果有一定的影響。筆者使用細(xì)菌超聲分散計數(shù)儀對MGIT 960培養(yǎng)物進(jìn)行超聲分散比濁，分析其在不同藥敏試驗中的應(yīng)用價值。

資料和方法

一、研究資料

1.資料收集：搜集2018年1—12月西安市胸科醫(yī)院經(jīng)MGIT 960液體分枝桿菌培養(yǎng)陽性的菌液標(biāo)本，共計1086份(培養(yǎng)陽性的菌液標(biāo)本來自于臨床各類型標(biāo)本，包含痰液、支氣管沖洗液及各類型體液標(biāo)本等)。其中，818份菌液標(biāo)本進(jìn)行MGIT 960 液體藥敏試驗，包括MGIT 960推薦方法處理的菌液標(biāo)本(簡稱“MGIT 960 法標(biāo)本”)100份、超聲分散比濁法處理的菌液標(biāo)本(簡稱“超聲比濁法標(biāo)本”)718份；268份菌液標(biāo)本進(jìn)行比例法藥敏試驗，包括傳統(tǒng)磨菌法處理的菌液標(biāo)本(簡稱“磨菌法標(biāo)本”)30份、超聲比濁法標(biāo)本238份。

2.儀器與試劑：MGIT 960 液體藥敏試驗應(yīng)用MGIT 960試劑盒(批號：804944；BACTECTMMGIT 960操作系統(tǒng)，購自美國BD公司)；比例法藥敏試驗應(yīng)用分枝桿菌羅氏培養(yǎng)基(培養(yǎng)法；批號：1806181；購自珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司)；細(xì)菌超聲分散計數(shù)儀(型號：BACspreaderTM1100)、比濁管(批號：20180119)、細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)液(批號：20180111)，均購自廣東體必康生物科技有限公司。

二、MGIT 960液體藥敏試驗(MGIT 960法)

1.MGIT 960法菌液準(zhǔn)備[3]：取MGIT 960系統(tǒng)報陽且菌種鑒定為MTB的菌液，以報陽當(dāng)天算作第0天，如果在第1、2天進(jìn)行操作，則直接為工作菌液進(jìn)行藥敏試驗接種；如果在第3～5天進(jìn)行操作，則用滅菌生理鹽水按照1∶5稀釋為工作菌液(1 ml 菌懸液，4 ml生理鹽水)，然后進(jìn)行藥敏試驗接種。

2.超聲分散比濁法菌液準(zhǔn)備[4]：取MGIT 960系統(tǒng)報陽且菌種鑒定為MTB的菌液，加入2 ml至磨菌管中。工作參數(shù)為超聲5 s、間隔5 s；持續(xù)1 min。超聲后記錄濁度。本次研究濁度范圍為0.4～1.0麥?zhǔn)蠁挝?。將相?yīng)的濁度稀釋至0.1麥?zhǔn)蠁挝坏墓ぷ饕篬3]，然后進(jìn)行藥敏試驗接種。

3.含藥培養(yǎng)基準(zhǔn)備[3]：于MGIT 960試劑盒取5只培養(yǎng)管。第一管標(biāo)記GC(空白對照)，其余4只管分別標(biāo)記Sm(鏈霉素)、INH(異煙肼)、RFP(利福平)、EMB(乙胺丁醇)。無菌操作下每管加入0.8 ml增菌劑；4 ml滅菌蒸餾水溶解藥物干粉，在相應(yīng)含藥標(biāo)記管加入100 μl相應(yīng)藥物；對照管內(nèi)加入0.5 ml 的1∶100倍稀釋的工作菌液(0.1 ml菌液，10 ml滅菌生理鹽水)，其余4管含藥培養(yǎng)基加入工作菌液0.5 ml，蓋緊螺旋蓋并混勻。

4.結(jié)果報告：將上述培養(yǎng)管放入MGIT 960系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)，等待報告結(jié)果。若報告X200則為活菌含量較少；報告X400則為活菌含量較高，雜菌生長，即污染；以上兩種結(jié)果表示試驗失敗。儀器正常報告藥敏結(jié)果則為試驗成功。該指標(biāo)為效果指標(biāo)，用于判斷試驗成功與否，而非評價指標(biāo)的依據(jù)。

三、比例法藥敏試驗

1. 超聲分散比濁法菌液準(zhǔn)備：取MGIT 960系統(tǒng)報陽且菌種鑒定為MTB的菌液，加入2 ml至磨菌管中，工作參數(shù)為超聲5 s、間隔5 s；持續(xù)1 min。超聲后記錄濁度。本次研究濁度范圍為0.4～1.0麥?zhǔn)蠁挝?。將相?yīng)的濁度稀釋至0.1麥?zhǔn)蠁挝坏墓ぷ饕?，將工作液?.1 ml進(jìn)行1∶10稀釋(0.5 ml菌液，4.5 ml滅菌生理鹽水)得到10-2菌懸液。將10-2菌懸液按1∶100稀釋(0.1 ml菌液，10 ml滅菌生理鹽水)得到10-4菌懸液。

2.傳統(tǒng)比濁法菌液準(zhǔn)備：取MGIT 960系統(tǒng)報陽且菌種鑒定為MTB的菌液，按照《結(jié)核病實(shí)驗室檢驗規(guī)程》[3]進(jìn)行磨菌操作，與標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，得到1麥?zhǔn)蠁挝还ぷ饕?，將工作液菌懸液?∶100稀釋(0.1 ml菌液，10 ml滅菌生理鹽水)得到10-2菌懸液，將10-2菌懸液按1∶100稀釋(0.1 ml菌液，10 ml 滅菌生理鹽水)得到10-4菌懸液。

3.藥敏試驗接種：將10-2、10-4菌懸液，分別接種到2支對照培養(yǎng)基及2支相應(yīng)含藥培養(yǎng)基上。恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)35～37 ℃，培養(yǎng)4周后進(jìn)行結(jié)果判讀[3]。若高稀釋度的對照培養(yǎng)基菌落數(shù)<20個，則判斷為試驗失敗；對照培養(yǎng)基菌落數(shù)≥20個則為試驗成功。該指標(biāo)為效果指標(biāo)，非評價指標(biāo)的依據(jù)。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。與傳統(tǒng)菌液標(biāo)本制備方法比較，分析超聲分散比濁法制備菌液標(biāo)本用于MGIT 960液體藥敏試驗和比例法藥敏試驗的效果。計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、超聲比濁法標(biāo)本用于液體藥敏試驗的價值

濁度為0.6～1.0麥?zhǔn)蠁挝痪簶?biāo)本進(jìn)行MGIT 960液體藥敏試驗報告結(jié)果的時間主要集中在8～10 d，而MGIT 960 法標(biāo)本報告結(jié)果時間則較均勻分布在5～14 d。應(yīng)用MGIT 960 法標(biāo)本進(jìn)行MGIT 960液體藥敏試驗時，系統(tǒng)報告X200的報告率為11.00%(11/100)，X400報告率為4.00%(4/100)。應(yīng)用超聲比濁法標(biāo)本進(jìn)行MGIT 960液體藥敏試驗時，不同濁度標(biāo)本系統(tǒng)X200報告率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=227.78，P<0.01)；濁度為0.4和0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)本系統(tǒng)X200報告率均高于MGIT 960菌液制備法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為27.75和9.12，P值均<0.01)；濁度為0.6～1.0麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)本系統(tǒng)X200報告率均低于MGIT 960菌液制備法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為11.41、9.94、12.43、12.79、11.28，P值均<0.01)。兩種方法制備菌液標(biāo)本系統(tǒng)X400報告率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.85，P=0.257)。具體見表1。

二、超聲比濁法標(biāo)本用于比例法藥敏試驗的價值

進(jìn)行二線抗結(jié)核藥物比例法藥敏試驗時，隨著繼續(xù)增菌天數(shù)的增加，應(yīng)用超聲分散比濁法處理的菌液標(biāo)本達(dá)到1麥?zhǔn)蠁挝粷岫裙ぷ饕旱谋嚷矢哂趥鹘y(tǒng)磨菌法處理的菌液標(biāo)本；增菌6～7 d后，應(yīng)用超聲分散比濁法處理的菌液標(biāo)本基本可以達(dá)到目標(biāo)濁度，而傳統(tǒng)磨菌法處理的標(biāo)本在增菌第7天時僅有80%達(dá)到目標(biāo)濁度(圖1)。應(yīng)用超聲分散比濁法處理的0.4～0.6麥?zhǔn)蠁挝痪簶?biāo)本進(jìn)行比例法藥敏試驗的成功率分別為4.00%(1/25)、12.50%(3/24)、42.86%(6/14)，均明顯低于磨菌法標(biāo)本[83.33%(25/30)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為34.43、26.80、7.51，P值均<0.05)；0.7～1.0麥?zhǔn)蠁挝痪簶?biāo)本試驗成功率分別為82.61%(19/23)、82.69%(43/52)、94.00%(47/50)、96.00%(48/50)，與磨菌法標(biāo)本試驗成功率相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為0.01、0.01、2.37、3.77，P值均>0.05)，見圖2。

表1 應(yīng)用超聲比濁法制備的不同濁度菌液標(biāo)本進(jìn)行MGIT 960液體藥敏試驗時系統(tǒng)報錯情況

注X200表示檢測標(biāo)本活菌含量較少；X400表示檢測標(biāo)本污染

圖1 超聲分散比濁法和傳統(tǒng)磨菌法制備菌液標(biāo)本達(dá)到比例法藥敏試驗標(biāo)本目標(biāo)濁度效果分析圖

圖2 采用超聲比濁法標(biāo)本和磨菌法標(biāo)本進(jìn)行二線抗結(jié)核藥物比例法藥敏試驗的效果比較

討 論

目前，MGIT 960液體培養(yǎng)和藥敏試驗系統(tǒng)已經(jīng)常規(guī)使用[5]。但在實(shí)際應(yīng)用過程中，MGIT 960藥敏試驗有一定的報錯率，且該方法目前僅針對一線抗結(jié)核藥物，而針對二線抗結(jié)核藥物的藥敏檢測還需應(yīng)用比例法藥敏試驗。MGIT 960液體培養(yǎng)物報陽后使用傳統(tǒng)磨菌法制備的菌液往往濁度不能達(dá)標(biāo)，需要進(jìn)一步增菌，從而延長了藥敏試驗結(jié)果報告時間。本次研究顯示，應(yīng)用超聲分散比濁法制備菌液標(biāo)本可以有效解決菌液標(biāo)本濁度達(dá)標(biāo)的問題。

MGIT 960液體培養(yǎng)時，培養(yǎng)管報陽時管內(nèi)的菌量是存在差異的，這種差異與每份標(biāo)本中含菌量有關(guān)。菌量較少的標(biāo)本，培養(yǎng)管內(nèi)會出現(xiàn)由單個細(xì)菌繁殖成的大塊索狀細(xì)菌團(tuán)，雖然其達(dá)到了報陽所需的耗氧量，但實(shí)際菌量往往較少，也不容易通過高速旋渦振蕩來分散。這部分培養(yǎng)物在進(jìn)行MGIT 960液體藥敏試驗時，系統(tǒng)報告X200(對照無生長)的概率很大。本研究結(jié)果顯示，超聲分散比濁法可將索狀生長的分枝桿菌有效分散，濁度為0.6～1.0麥?zhǔn)蠁挝痪簶悠废到y(tǒng)X200報告率明顯低于MGIT 960法制備的菌液樣品。雖然報告結(jié)果時間固定在8～10 d，但減少了重復(fù)試驗的幾率，對患者治療及試驗成本的節(jié)約都具有一定的優(yōu)勢。此外，超聲分散比濁法雖然增加了比濁的試驗步驟，但只要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，系統(tǒng)報告X400(污染)的概率與MGIT 960法沒有太大差異。

在比例法藥敏試驗中，如果使用傳統(tǒng)的磨菌瓶磨菌，因技術(shù)限制，需要的菌量大，MGIT 960液體培養(yǎng)報陽后，往往達(dá)不到1麥?zhǔn)蠁挝?，需要將培養(yǎng)物繼續(xù)放在孵育箱內(nèi)進(jìn)行增菌。如此，則藥敏試驗時間就會增加，甚至延長到1周以上，延誤了結(jié)果的報告時間。MGIT 960液體培養(yǎng)報陽后樣品利用超聲分散比濁法磨菌，不存在菌液浪費(fèi)，菌量基本能滿足0.7麥?zhǔn)蠁挝?，?.7～1.0麥?zhǔn)蠁挝环秶鷥?nèi)菌液標(biāo)本進(jìn)行比例法藥敏試驗的成功率與傳統(tǒng)磨菌法制備標(biāo)本相近。因此，應(yīng)用超聲分散比濁法處理菌液標(biāo)品在保證了藥敏試驗成功率的前提下，可以縮短試驗時間。

綜上，本次研究結(jié)果顯示，使用超聲分散比濁法制備菌液標(biāo)本用于MGIT 960液體藥敏試驗可以減少出錯率；用于固體比例法藥敏試驗可以縮短試驗時間。并且，已有研究顯示，超聲分散比濁法處理菌液標(biāo)本并不影響MTB菌株活性，對藥敏試驗的結(jié)果無影響[4, 6]。特別強(qiáng)調(diào)，本次研究主要探討效果性指標(biāo)，并未關(guān)注應(yīng)用超聲分散比濁法處理菌液標(biāo)本對藥敏試驗準(zhǔn)確性和重復(fù)性的影響。