丁光貴 賀星 梁娟 劉亞亞 歐敏 陸堅 張國良

結(jié)核分枝桿菌(MTB)是典型的胞內(nèi)致病菌，其感染宿主后主要在宿主免疫細胞如巨噬細胞內(nèi)存活和繁殖[1]，同時機體免疫系統(tǒng)可以誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡以控制MTB的進一步傳播[2]，促進MTB的清除。當細胞受到物理(如電離輻射)、化學(xué)(如過氧化氫)、生物等刺激時，為了適應(yīng)或抵抗刺激，細胞可產(chǎn)生大量的活性氧簇，活性氧簇的大量產(chǎn)生可使細胞發(fā)生一系列的變化，如脂質(zhì)過氧化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等，同時影響機體凋亡相關(guān)標志物的水平，進而誘發(fā)凋亡[3-6]。小非編碼RNA家族(miR-17～92)是研究最廣泛的具有致癌功能的基因簇，miR-20a是其中一員[3]，其既可以通過直接調(diào)控與細胞凋亡和增殖相關(guān)的基因來促進癌癥發(fā)病[4-5]，也可以被過表達miR-17～92的人肺癌細胞系退行性癌細胞(Calu6)中的反義寡核苷酸介導(dǎo)的細胞凋亡抑制，有著明確的致癌作用[6]。但在人類白血病治療過程中發(fā)現(xiàn)，在人慢性髓系白血病細胞系K562細胞中，miR-20a的表達受到了具有強抗癌活性的天然提取物冬凌草甲素的抑制，進一步引發(fā)了該細胞的凋亡及逆轉(zhuǎn)耐藥性[7]。

筆者在前期基因芯片分析的研究中顯示，活動性肺結(jié)核患者的CD14+單核細胞中有14個miRNA下調(diào)，但在抗結(jié)核藥物治療后只有miR-20a-5p的下調(diào)可逆轉(zhuǎn)[8]。此外，由人單核細胞(THP-1)誘導(dǎo)分化的巨噬細胞(簡稱“THP-1巨噬細胞”)在體外MTB感染后，miR-20a-5p表達水平降低[9]。因此，鑒于巨噬細胞凋亡在控制MTB感染中的重要作用、miR-20a在調(diào)節(jié)癌細胞凋亡中的重要功能，以及其在MTB感染后下調(diào)的特征，本研究進一步探討MTB感染過程中miR-20a-5p的水平與人巨噬細胞凋亡相關(guān)基因表達的關(guān)系。

材料和方法

一、 主要材料、試劑及儀器

佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA，20 ng/ml)購自美國Sigma公司，用于誘導(dǎo)THP-1細胞分化為巨噬細胞；胎牛血清和RPMI 1640完全培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；抗凋亡基因Bcl-2抗體(貨號：#4223S)，促凋亡基因Bad抗體(貨號：#9239S)、Bim抗體(貨號：#2933S)、Bax抗體(貨號：#5023S)，均購自美國Cell Signaling公司，用于蛋白免疫印跡試驗；THP-1人單核細胞由深圳第三人民醫(yī)院提供；miR-20a-5p及其抑制子慢病毒(miR-20a-5p-inh)包裝、攜帶綠色熒光蛋白(GFP)基因的慢病毒載體(pGLV3-GFP)均由上海吉凱基因公司提供；cDNA、oligo-dT引物用于莖環(huán)寡核苷酸的合成過程、SuperScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶及熒光定量實時PCR反應(yīng)混合液由日本TaKaRa公司提供；microRNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；TaqManTMAdvanced miRNA cDNA合成試劑盒和生物系統(tǒng)vii7序列檢測系統(tǒng)均由美國ABI公司提供?；瘜W(xué)發(fā)光增強試劑購自美國Thermo公司。β-actin 兔抗大鼠一抗及羊抗兔二抗購自美國Promega 公司。

二、研究方法

1.慢病毒介導(dǎo)miR-20a-5p上調(diào)或下調(diào)：通過表達或抑制miR-20a-5p的慢病毒載體來介導(dǎo)miR-20a-5p的上調(diào)和下調(diào)。相關(guān)寡核苷酸序列如下：miR-20a-5p，5′-TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG-3′；miR-20a-5p-inh(為轉(zhuǎn)染了miR-20a-5p抑制劑的miR-20a-5p，主要功能為抑制miR-20a-5p的表達)，5′-GATGGTGCAGATATTGCACTTTT-3′。由oligo-dT引物通過固相亞磷酰胺法合成莖環(huán)寡核苷酸，并克隆到慢病毒載體pGLV3-GFP內(nèi)。以通用引物序列(LV1-NC：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)作為慢病毒載體的陰性對照。

2.感染慢病毒的GFP+THP-1細胞分選及刺激：將構(gòu)建的miR-20a-5p、miR-20a-5p-inh以及LV1-NC陰性對照在聚凝胺為5 μg/ml時以感染復(fù)數(shù)(MOI)為10的條件下轉(zhuǎn)染THP-1人巨噬細胞3 h，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細胞3次后，將細胞放入含10%胎牛血清、1%抗生素或抗真菌溶液(青霉素和鏈霉素)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，用流式細胞儀分選出GFP+THP-1細胞，并分別采用減毒MTB菌株(H37Ra，菌株號ATCC35835)感染8 h和過氧化氫(H2O2)處理30 min 兩種方法刺激。

3.提取總RNA及測定miR-20a-5p的表達：使用microRNA提取試劑盒從GFP+THP-1細胞中提取總RNA，應(yīng)用TaqMan Advanced miRNA cDNA合成試劑盒測定miR-20a-5p，以RNU6B作為管家基因。

4.凋亡相關(guān)基因測定：應(yīng)用生物系統(tǒng)vii7序列檢測系統(tǒng)，采用RNA提取物2 μl在SuperScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶的作用行逆轉(zhuǎn)錄-(reverse transcription，RT)反應(yīng)，從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，在DNA聚合酶作用下行PCR擴增合成目的片段，形成20 μl的PCR混合液，包括TaqManTM反應(yīng)混合液以及制造商(生工生物科技有限公司)合成的特異性miRNA引物。其中cDNA、oligo-dT引物、逆轉(zhuǎn)錄酶，實時熒光定量PCR反應(yīng)混合液和一組基因特異性寡核苷酸引物通過實時熒光定量PCR測定細胞凋亡過程中miR-20a-5p的相關(guān)基因表達，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為管家基因，該酶在同種細胞或者組織中的表達量一般是恒定的，且不受含有的部分識別位點、佛波脂等的誘導(dǎo)物質(zhì)的影響而保持恒定，故被廣泛用作標準化的內(nèi)參。特異性基因引物設(shè)計如下：Bcl-2，5′-GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3′(正向)，5′-CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3′(反向)；Bax，5′-CCCGA-GAGGTCTTTTTCCGAG-3′(正向)，5′-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3′(反向)；Bim, 5′-TAAGTTCTGAGTGTGACCGAGA-3′(正向)，5′-GCTCTGTCTGTAGGGAGGTAGG-3′(反向)；Bad，5′-CCCAGAGTTTGAGCCGAGTG-3′(正向)，5′-CCCATCCCTTCGTCGTCCT-3′ (反向)，擴增的反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。

5.蛋白免疫印跡法(Western blotting，WB)測定抗(促)細胞凋亡蛋白水平：用細胞裂解液[含50 mmol/L 三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液(Tris-HCl)，pH 8.0，1%乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，2 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)，10 mmol/L NaCl，2 mg/ml抑肽酶，5 mg/ml亮肽素，2 mg/ml胃蛋白酶抑制劑，1 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)，0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)和1 mmol/L苯甲基磺酰氟]制備細胞蛋白。通過12% SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的蛋白質(zhì)(50 μg)，然后通過電印跡將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。膜用含5% 牛血清白蛋白(BSA)的TBST緩沖液(含10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl和0.05%吐溫-20)封閉1 h，然后與Bcl-2抗體(稀釋度1∶1000)、Bad抗體(稀釋度1∶100)、Bim抗體(稀釋度1∶1000)、Bax(稀釋度1∶100)各4 μl、一抗共同在4 ℃孵育12 h過夜，隨后與辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗在37 ℃孵育1 h，使蛋白質(zhì)經(jīng)化學(xué)發(fā)光增強劑在X線膠片上曝光。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、慢病毒感染后不同刺激條件下miR-20a-5p的表達水平

以無刺激的慢病毒感染的GFP+THP-1組為陰性對照組，在無刺激物刺激的THP-1細胞中，由于內(nèi)源性miR-20a-5p較高，所以未觀察到miR-20a-5p與LV1-NC、miR-20a-5p-inh的表達差異(圖1)。在減毒菌株H37Ra和H2O2刺激的GFP+THP-1細胞中，miR-20a-5p的表達為上調(diào)或下調(diào)，即miR-20a-5p過表達時水平明顯增加，而miR-20a-5p受抑制時水平明顯降低(圖2，3)。具體見表1。

二、上調(diào)或下調(diào)miR-20a-5p后線粒體相關(guān)抗(促)凋亡基因表達水平

miR-20a-5p上調(diào)和下調(diào)后，使用實時熒光定量PCR測定法檢測線粒體相關(guān)抗凋亡基因Bcl-2及促凋亡基因Bax、Bim和Bad的轉(zhuǎn)錄水平情況。在感染miR-20a-5p慢病毒的THP-1細胞中，H37Ra誘導(dǎo)抗凋亡基因Bcl-2的表達增加，而感染miR-20a-5p-inh慢病毒時Bcl-2表達減少(圖4)；Bim基因呈現(xiàn)相反的結(jié)果，即在miR-20a-5p過表達的THP-1細胞中促凋亡基因Bim的轉(zhuǎn)錄水平減少，當miR-20a-5p受抑制時Bim的轉(zhuǎn)錄水平增加(圖5)；Bax和Bad基因表達水平在不同組別之間無明顯變化，未受miR-20a-5p影響(圖6，7)。具體見表2。

三、WB檢測H37Ra感染的GFP+THP-1細胞中抗(促)細胞凋亡蛋白表達水平

利用WB檢測H37Ra感染的GFP+THP-1細胞中線粒體相關(guān)抗凋亡基因Bcl-2以及促凋亡基因Bax、Bim和Bad的蛋白表達水平。結(jié)果與相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平相吻合。以人的肌動蛋白(β-actin)為

圖1～3 miR-20a-5p水平對THP-1巨噬細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響。LV1-NC為通用引物序列(5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)。圖1為在無誘導(dǎo)的情況下檢測到慢病毒感染后GFP+THP-1細胞中的LV1-NC、miR-20a-5p和miR-20a-5p-inh的表達，miR-20a-5p及miR-20a-5p-inh組分別與LV1-NC組對比，表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義；圖2、3分別在H37Ra和H2O2誘導(dǎo)下檢測到慢病毒感染后GFP+ THP-1細胞中miR-20a-5p及miR-20a-5p-inh的表達與LV1-NC組對比，表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義

刺激條件LV1-NC(x±s,相對熒光強度)miR-20a-5p(x±s,相對熒光強度)q值aP值amiR-20a-5p-inh(x±s,相對熒光強度)q值bP值b未刺激10.64±0.9612.21±1.291.8150.3859.68±1.382.0720.602H37Ra刺激4.46±0.077.20±0.5350.2500.0071.88±0.081.041<0.01H2O2刺激5.49±0.448.55±0.823.4570.0311.44±0.214.3840.001

注a：為不同刺激條件下miR-20a-5p組與LV1-NC組數(shù)據(jù)比較；b：為不同刺激條件下miR-20a-5p-inh組與LV1-NC組數(shù)據(jù)的比較內(nèi)參，陰性慢病毒感染組為陽性對照，抗凋亡基因Bcl-2、促凋亡基因Bim、Bax和Bad在miR-20a-5p、miR-20a-5p-inh慢病毒轉(zhuǎn)染的THP-1細胞中的蛋白表達水平見圖8。

圖4～7 miR-20a-5p上調(diào)和下調(diào)后，使用實時熒光定量PCR檢測線粒體相關(guān)抗(促)凋亡基因表達情況。圖4為Bcl-2基因表達在miR-20a-5p慢病毒轉(zhuǎn)染的THP-1細胞誘導(dǎo)的巨噬細胞中增加，在miR-20a-5p-inh慢病毒轉(zhuǎn)染的THP-1細胞中減少；圖5為Bim基因呈現(xiàn)相反的結(jié)果；圖6、7為Bax和Bad基因在不同組別之間表達無差異

基因類型LV1-NC(x±s,相對熒光強度)miR-20a-5p(x±s,相對熒光強度)q值aP值amiR-20a-5p-inh(x±s,相對熒光強度)q值bP值bBcl-210.67±0.8914.98±0.881.0640.0086.49±0.473.5180.003Bim1.22±0.050.98±0.041.2400.0111.51±0.082.4600.021Bax11.69±1.3112.30±1.892.0880.79711.98±0.782.7790.851Bad2.91±0.203.51±0.352.9480.1893.68±0.151.9010.017

注a：為miR-20a-5p組與LV1-NC組間的數(shù)據(jù)比較；b：為miR-20a-5p-inh組與LV1-NC組間的數(shù)據(jù)比較

圖8 Western blotting檢測H37Ra感染的GFP+THP-1細胞中的抗(促)細胞凋亡蛋白表達。以人的肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參。Bcl-2的蛋白表達水平在miR-20a-5p過表達的THP-1細胞中增加，在miR-20a-5p受抑制的THP-1細胞中減少；Bim的蛋白表達水平在miR-20a-5p過表達的THP-1細胞中減少，在miR-20a-5p受抑制的THP-1細胞中增加。Bax和Bad的蛋白表達水平?jīng)]有觀察到明顯差別

討 論

細胞凋亡是指細胞在一定的病理和生理條件下，機體為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，由基因控制的、高度有序的并有一系列酶參與的自主性死亡[10]。有研究表明，MTB可以在體外感染實驗中誘導(dǎo)來源于人血或人巨噬細胞樣細胞系單核細胞中的巨噬細胞凋亡[11-12]，在其感染宿主巨噬細胞后，通過降低巨噬細胞的凋亡來逃避殺傷[13-14]。因此，細胞凋亡是細胞內(nèi)分枝桿菌感染后的重要免疫防御反應(yīng)，機體可通過對抗細胞內(nèi)分枝桿菌的防御機制來降低各種分枝桿菌的生存能力。

在MTB感染過程中，巨噬細胞中多個分子及其相關(guān)的信號通路均參與了巨噬細胞凋亡的調(diào)節(jié)，如線粒體外膜透化作用(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)是激活內(nèi)源性細胞凋亡途徑所必需的相關(guān)機制[15-16]。在被MTB弱毒株感染的巨噬細胞中，人體免疫機制通過細胞凋亡介導(dǎo)蛋白質(zhì)的Bcl-2家族成員誘導(dǎo)線粒體外膜透化作用時，使線粒體外膜透化作用和細胞凋亡能夠獨自引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換(mitochondrial permeability transition，MPT)[16]。髓系細胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)基因作為Bcl-2家族成員之一，可以通過維持線粒體膜穩(wěn)定性，抑制細胞色素C的釋放，促進細胞生存，抑制細胞凋亡，其信號傳導(dǎo)途徑一般有3種：Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號途徑、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK) 信號途徑和磷脂酰肌醇激活 (phosphatidy linositol 3-kinase, PI-3K) 信號途徑[17]。其中，Bim是依賴促分裂原活化蛋白激酶通路介導(dǎo)MTB誘導(dǎo)細胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[18-19]。沉默線粒體膜間隙釋放細胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子所需的促細胞凋亡的Bcl-2樣蛋白Bax基因，消除了MTB誘導(dǎo)的細胞凋亡[16]。MTB感染可明顯增加Bim表達，故下調(diào)Bim的表達水平可明顯消除臨床分離株MT103誘導(dǎo)的細胞凋亡[17]。

miRNAs是22個核苷酸長、非編碼、高度保守的單鏈RNA，通過靶向蛋白質(zhì)編碼基因的miRNA在調(diào)節(jié)基因表達中發(fā)揮關(guān)鍵作用。miRNA的靶蛋白可以通過直接或間接方式參與細胞周期進程、細胞增殖和細胞凋亡[19]，如miRNA靶蛋白miR-483-3P在對惡性腫瘤葡萄糖調(diào)節(jié)的信號通路中起到重要作用[20]；Alu RNA通過調(diào)節(jié)miR-566表達水平以誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而影響腫瘤進程[21]。張娟娟等[22]在MTB誘導(dǎo)細胞凋亡的研究中也成功闡釋了miR-20a-5p的關(guān)鍵作用，認為miR-20a-5p上調(diào)的THP-1巨噬細胞在H37Ra感染及H2O2刺激后，細胞凋亡的形態(tài)情況經(jīng)流式細胞儀分析，顯示未出現(xiàn)明顯變化；當miR-20a-5p下調(diào)或抑制時細胞凋亡卻明顯增加；然而，其研究缺乏對細胞凋亡相關(guān)基因及凋亡蛋白標記物的驗證。本研究通過WB法再次從相關(guān)基因和蛋白水平進行了驗證，結(jié)果與基因轉(zhuǎn)錄水平相符。值得注意的是，筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p的表達在肺結(jié)核患者中是下調(diào)的，并在成功進行抗結(jié)核藥物治療后恢復(fù)[9]。提示miR-20-5P是抗結(jié)核免疫過程中的關(guān)鍵分子，miRNAs一般通過與目的基因3′端的非翻譯區(qū)結(jié)合來調(diào)控靶基因的表達水平。

有研究指出，H2O2是已知誘導(dǎo)細胞強烈凋亡的刺激因素，但對MTB作為誘導(dǎo)細胞凋亡的情況及機制還不明確，故本研究使用H2O2誘導(dǎo)細胞凋亡做為陽性對照與MTB相比較，以明確MTB誘導(dǎo)細胞凋亡的作用[3-6]。在本研究中，筆者將LV1-NC、miR-20a-5p、miR-20a-5p-inh慢病毒載體轉(zhuǎn)染到THP-1細胞，分選出GFP+THP-1細胞并將其分化成巨噬細胞，用H37Ra或H2O2處理細胞，通過調(diào)控miR-20a-5p表達水平觀察對MTB感染的人巨噬細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響，探討宿主抗MTB感染的分子機制。研究結(jié)果表明，在無刺激物刺激的THP-1細胞中，由于內(nèi)源性miR-20a-5p表達較高，未觀察到miR-20a-5p與LV1-NC、miR-20a-5p-inh的表達差異；但在減毒菌株H37Ra和H2O2刺激的GFP+THP-1細胞中，miR-20a-5p過表達2倍以上，轉(zhuǎn)染了miR-20a-5p-inh慢病毒后表達水平降低至原來的1/4；另外，miR-20a-5p的表達水平可影響感染巨噬細胞的凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bim的表達，并與促凋亡基因Bim的水平呈負相關(guān)，提示miR-20a-5p是MTB觸發(fā)細胞凋亡的負調(diào)節(jié)物，當MTB感染時可以通過下調(diào)miR-20a-5p的表達水平來增加Bim的表達，從而促進細胞凋亡，最終控制MTB感染。

綜上所述，MTB感染巨噬細胞后，miR-20a-5p通過調(diào)控巨噬細胞凋亡介導(dǎo)MTB的清除，這將作為臨床控制MTB感染的新途徑。故認為miR-20a-5p可能成為肺結(jié)核的生物標志物，并可通過與抗結(jié)核藥物的聯(lián)合治療調(diào)控其特異性表達，進而靶向治療結(jié)核病。