李思佳 王中英 陳麗娟

[摘要] 目的 探討Cx46與晶狀體上皮細胞凋亡和年齡相關性白內(nèi)障的相關性。 方法 建立H2O2（濃度為100 μM）介導的晶狀體上皮細胞（SRA01/04）凋亡模型，用Western blotting實驗檢測Cx46蛋白表達量。利用MTT技術分析細胞生存率。利用Hoechst33342染料固定分析細胞凋亡情況。 結(jié)果 試驗數(shù)據(jù)闡明H2O2（濃度為100 μM）是導致晶狀體上皮細胞凋亡的重要誘導因素。Cx46低表達與H2O2介導的人晶狀體上皮細胞凋亡相關[蛋白表達量：H2O2 50 μM（177.67±3.65） vs H2O2 100 μM（139.02±2.13）（P<0.05）]。Cx46過表達能抑制H2O2介導的人晶狀體上皮細胞凋亡進程[凋亡率：Cx46（24.36±3.13）% vs H2O2（43.65±7.51）%（P<0.01）]。 結(jié)論 研究數(shù)據(jù)確定凋亡的晶狀體上皮細胞中Cx46低表達與年齡相關性白內(nèi)障的發(fā)生直接相關。

[關鍵詞] 縫隙連接蛋白Cx46;晶狀體上皮細胞;凋亡;年齡相關性白內(nèi)障

[中圖分類號] R779.66 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2019）14-0019-04

[Abstract] Objective To explore the correlation between Cx46 and lens epithelial cell apoptosis， age-related cataract. Methods The apoptosis model of lens epithelial cells（SRA01/04） mediated by H2O2（concentration of 100 μM） was established. The expression of Cx46 protein was detected by Western blotting. Cell viability was analyzed using MTT technology. Cell apoptosis was analyzed by Hoechst 33342 dye fixation. Results The experimental data demonstrated that H2O2（concentration of 100 μM） was an important inducer of apoptosis in lens epithelial cells. Low expression of Cx46 was associated with H2O2-mediated apoptosis of human lens epithelial cells[protein expression： H2O2 50 μM（177.67±3.65） vs H2O2 100 μM （139.02±2.13）]（P<0.05）. Overexpression of Cx46 inhibited H2O2-mediated apoptosis in human lens epithelial cells[apoptosis rate： Cx46 （24.36±3.13）% vs H2O2 （43.65±7.51）%]（P<0.01）. Conclusion The study data determine that low expression of Cx46 in apoptotic lens epithelial cells is directly associated with the development of age-related cataract.

[Key words] Connexin Cx46; Lens epithelial cells; Apoptosis; Age-related cataract

年齡相關性白內(nèi)障（ARC）位居全世界致盲性疾病首位。大量研究證實氧化應激引起的晶狀體上皮細胞損傷是白內(nèi)障發(fā)生的主要機制。Cx46是表達于人眼晶狀體的一種縫隙連接蛋白，其形成的縫隙連接通道能維持晶狀體細胞內(nèi)部離子和水平衡以及晶狀體的透明度和光學特性，同時Cx46也參與調(diào)控細胞的很多生命進程，包括生長、增殖、分化、保護及細胞凋亡。本研究探討Cx46的表達情況與晶狀體上皮細胞凋亡及年齡相關性白內(nèi)障的發(fā)生相關。

1 材料與方法

1.1 材料

培養(yǎng)液DMEM、緩沖液PBS（美國HyClone公司），6孔板（美國CoStar公司），細胞凍存瓶、離心管（美國Corning公司），鼠抗人β-Actin單克隆抗體（美國Sigma公司），兔抗人HIF-1α多克隆抗體（美國Abcam公司），辣根酶標記山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗、辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）二抗、兔二步法試劑盒、DAB顯色試劑盒、檸檬酸鹽修復液、PBS緩沖液粉末、陽離子防脫玻片、中性樹膠（北京中衫生物技術有限公司）。

1.2 細胞的培養(yǎng)、過氧化氫處理和轉(zhuǎn)染

SRA01/04細胞（中國廣州吉尼歐生物科技有限公司）培養(yǎng)基為含10%胎牛血清（FBS）和100 mg/mL鏈霉素的DMEM液，在潮濕、含5% CO2、37℃環(huán)境下孵育。細胞生長密度為80%后進行過氧化氫處理。

相應的DNA質(zhì)粒依據(jù)脂質(zhì)體3000（Invitrogen）使用說明書瞬時轉(zhuǎn)染SRA01/04細胞。

1.3 質(zhì)粒構建

構建Cx46-GFP融合蛋白，PCR擴增產(chǎn)物，引物序列如下：正向引物5-CCGCTCGAGATGGGCGACTGGAGCTTTCTGG-3;反向引物5-CCCAAGCTTGATGGCCAAGTCCTCCGGTCTGG-3。然后將擴增產(chǎn)物克隆到經(jīng)XhoI和HindIII限制性內(nèi)切酶作用后的GFP載體上。

1.4 細胞活性和MTT分析

利用MTT法分析測定細胞活性。細胞轉(zhuǎn)染和特殊處理后，在5 mg/mL MTT溶液中孵育4 h。移棄上清液，再溶于二甲亞砜溶液中。細胞活性可利用酶標儀測定其492 nm波長處光吸收值。

1.5 凋亡檢測

細胞凋亡的檢測通過使用33342染料（Sigma公司）觀察細胞核形態(tài)的改變。細胞平鋪于6孔板上培養(yǎng)，經(jīng)33342染料固定后在顯微鏡下進行分析。隨機選取5個鏡下視野統(tǒng)計凋亡的細胞核數(shù)量。

1.6 Western blotting實驗

經(jīng)轉(zhuǎn)染以及過氧化氫處理后，SRA01/04細胞裂解提蛋白。將總蛋白直接上樣到12% SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，經(jīng)特異性抗Cx46抗體（抗β-actin抗體作為內(nèi)參）及二抗孵育后，利用皮爾斯公司的SuperSignal West Pico試劑盒的化學發(fā)光底物法，對信號進行可視化。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗分析，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 Cx46低表達與H2O2介導的晶狀體上皮細胞凋亡相關

利用Western blotting試驗分析比較Cx46在對照組SRA01/04細胞和高濃度過氧化氫條件下SRA01/04細胞中的蛋白表達量。見圖1，在100 μM過氧化氫環(huán)境中Cx46蛋白的表達水平降低[H2O2 50 μM（177.67±3.65） vs H2O2 100 μM（139.02±2.13）（P<0.05）]，表明Cx46的低表達與過氧化氫介導的晶狀體上皮細胞凋亡相關。

2.2 Cx46蛋白在調(diào)節(jié)由過氧化氫介導的晶狀體上皮細胞凋亡中起到重要作用

為進一步闡述Cx46在過氧化氫介導的SRA01/04細胞凋亡中的作用，本研究構建Cx46特異性表達質(zhì)粒，并通過Western blotting試驗確定轉(zhuǎn)染此特異性表達質(zhì)粒后Cx46蛋白表達量明顯增加[vector（133.20±4.50） vs Cx46（181.98±1.30）（P<0.05）]（圖2）。

隨后本研究進行轉(zhuǎn)染Cx46表達質(zhì)粒后細胞增殖能力比較。轉(zhuǎn)染Cx46表達質(zhì)粒，并在H2O2環(huán)境下作用24 h后，其OD值為（0.29±0.03），與無H2O2環(huán)境下對照組（0.33±0.02）比較，對SRA01/04細胞的增殖具有顯著抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在H2O2處理下，轉(zhuǎn)染Cx46表達質(zhì)粒后，其OD值為（0.29±0.03），與未轉(zhuǎn)染Cx46表達質(zhì)粒組（0.20±0.01）比較，對SRA01/04細胞的增殖具有顯著促進作用，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。證實通過轉(zhuǎn)染Cx46表達質(zhì)粒能夠有效地恢復過氧化氫降低晶狀體上皮細胞生存能力的水平（圖3）。

最后，本研究分析Cx46過表達對過氧化氫介導的細胞凋亡的抑制情況。轉(zhuǎn)染Cx46表達質(zhì)粒，并在H2O2環(huán)境下作用24 h后，凋亡率為（24.36±3.13）%，與無H2O2環(huán)境下對照組（6.48±1.34）%比較，SRA01/04細胞的凋亡差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在H2O2處理下，轉(zhuǎn)染Cx46表達質(zhì)粒后，凋亡率為（24.36±3.13）%，與未轉(zhuǎn)染Cx46表達質(zhì)粒組（43.65±7.51）%比較，對SRA01/04細胞的凋亡具有顯著抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。說明Cx46過表達抑制了過氧化氫介導的SRA01/04細胞凋亡（圖4）。這些結(jié)果證實Cx46下調(diào)是過氧化氫導致SRA01/04細胞凋亡所必須的。

3 討論

年齡相關性白內(nèi)障（ARC）位居全世界致盲性疾病首位[1]。調(diào)查顯示，如果白內(nèi)障發(fā)病時間能延緩十年，其手術量將會減少45%[2]，對整個社會而言將是上百億元的受益。這些潛在的利益驅(qū)使著人們?nèi)ヌ剿鞣鞘中g治療白內(nèi)障的方法。因而本研究要深入研究并闡明ARC發(fā)生發(fā)展的具體分子機制。

大量的研究證實氧化應激引起的細胞損傷是白內(nèi)障發(fā)生的主要機制[3-5]。氧化應激在各類晶狀體蛋白質(zhì)（包括酶類、晶狀體蛋白和其他伴侶蛋白質(zhì)）的降解、氧化、交聯(lián)和聚集等生命進程中均扮演重要角色，同時也是晶狀體上皮細胞凋亡的觸發(fā)點，這些被認為是白內(nèi)障發(fā)生與發(fā)展的普遍分子基礎[6，7]。過氧化氫產(chǎn)生的氧化自由基存在于眼球的前房內(nèi)，來源于晶狀體上皮細胞的線粒體代謝進程，是晶狀體上皮細胞氧化損傷的根源[8]。據(jù)報道，白內(nèi)障患者的房水中表達高含量的過氧化氫，因此，對過氧化氫介導晶狀體上皮細胞凋亡的分子機制的認知可能為白內(nèi)障的診療提供新方法。以往研究報道稱一些細胞通路和基因在晶狀體上皮細胞凋亡進程中扮演著重要角色，例如Caspase3、bcl-2、hGSTA1和hGSTA2等基因[9-12]。但上述這些基因介導晶狀體上皮細胞凋亡的詳盡機制學研究尚待進一步討論。

細胞間的縫隙連接是由縫隙連接蛋白組成的跨膜轉(zhuǎn)運通道[13]。其主要功能是介導相鄰細胞間離子和小分子物質(zhì)的直接交換。Cx46是表達于人眼晶狀體的一種縫隙連接蛋白，其形成的縫隙連接通道能維持晶狀體細胞內(nèi)部離子和水平衡以及晶狀體的透明度和光學特性，同時Cx46也參與調(diào)控細胞的很多生命進程，包括生長、增殖、分化、保護及細胞凋亡。在晶狀體組織中Cx46的表達對于維持細胞間縫隙連接通道的傳遞起決定性的作用[14，15]，但是Cx46如何表達和其在晶狀體上皮細胞凋亡中起到何種作用的了解卻很少。

本研究的目的為進一步詳盡地闡述過氧化氫介導的晶狀體上皮細胞凋亡的機制。試驗數(shù)據(jù)證實高濃度的過氧化氫（100 μM）是晶狀體上皮細胞凋亡的有效誘導物，Cx46的低表達與此凋亡進程相關（圖1），并且過表達的內(nèi)源性Cx46能夠抑制晶狀體上皮細胞的凋亡（圖2和圖3）。以上數(shù)據(jù)表明Cx46是過氧化氫介導晶狀體上皮細胞凋亡所必須的，將成為預防年齡相關性白內(nèi)障發(fā)生的新的分子靶點。

研究中發(fā)現(xiàn)Cx46的低表達與過氧化氫介導SRA01/04細胞凋亡直接相關（圖1），編碼Cx46的GJA3基因確切的表達于晶狀體上皮細胞，這與Banerjee D等[13]的研究一致，其認為Cx46表達于人類和兔的晶狀體上皮細胞，并且于晶狀體的功能而言是必須的。以往研究顯示Cx46只表達于晶狀體纖維細胞[16]，本研究推測，Cx46不僅主要存在于晶狀體纖維細胞，同時在上皮細胞中也有表達，并且在晶狀體上皮細胞凋亡進程中扮演重要作用。

本研究證實了Cx46低表達與過氧化氫介導晶狀體上皮細胞凋亡密切相關，其過表達能夠抑制其凋亡進程，意味著Cx46在過氧化氫介導的晶狀體上皮細胞凋亡進程中起重要作用，并與白內(nèi)障的發(fā)生直接相關。

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（收稿日期：2019-01-30）