楊冬艷　龐麗紅

【摘要】 產(chǎn)前診斷是指對(duì)胎兒進(jìn)行先天性缺陷和遺傳性疾病的診斷，是防控出生缺陷及提高人口素質(zhì)的主要手段。產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法多樣，從20世紀(jì)60年代的染色體核型分析發(fā)展到現(xiàn)在的基因測(cè)序技術(shù)，各種產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)?，F(xiàn)就產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展及各產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的特點(diǎn)展開(kāi)綜述。

【關(guān)鍵詞】 產(chǎn)前診斷; 染色體核型分析; 基因測(cè)序

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.13.084 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1674-6805（2019）13-0-04

近年來(lái)隨著高齡妊娠人數(shù)和環(huán)境污染的增加，出生缺陷的發(fā)生率在逐年上升。產(chǎn)前診斷可以有效地預(yù)防出生缺陷的發(fā)生，所以產(chǎn)前診斷越來(lái)越受到社會(huì)各界的重視。產(chǎn)前診斷技術(shù)是為了盡量控制出生缺陷，而通過(guò)各種方法檢測(cè)胎兒出生前患某種遺傳性疾病或先天畸形與否。產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)主要包括：（1）染色體核型分析;（2）分子細(xì)胞遺傳學(xué)分析技術(shù)：熒光原位雜交（FISH）、微陣列芯片雜交技術(shù)等;（3）PCR;（4）多重連接依賴(lài)式探針擴(kuò)增;（5）基因測(cè)序技術(shù)：一代測(cè)序、二代測(cè)序、三代測(cè)序、正在研究的四代測(cè)序技術(shù)等。各種產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，下面筆者逐一展開(kāi)敘述。

1 染色體核型分析

自20世紀(jì)60年代開(kāi)始染色體核型分析技術(shù)已作為臨床上進(jìn)行產(chǎn)前診斷染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)，常染色體核型分析技術(shù)在產(chǎn)前診斷中有G、Q、R、C、N等顯帶技術(shù)，可根據(jù)不同的需求來(lái)選擇。G帶帶型比較穩(wěn)定，是最常使用的人類(lèi)染色體核型分析檢測(cè)顯帶技術(shù)。目前鑒別G顯帶核型標(biāo)準(zhǔn)仍然是由人類(lèi)細(xì)胞遺傳命名國(guó)際體系規(guī)定的，檢測(cè)的染色體是通過(guò)與其比對(duì)來(lái)判定改變與否。臨床上常見(jiàn)的遺傳病及染色體突變通過(guò)G顯帶核型分析技術(shù)來(lái)檢測(cè)準(zhǔn)確可靠，該技術(shù)應(yīng)用廣泛。為降低出生缺陷、提高出生人口素質(zhì)，目前我國(guó)采用對(duì)所有孕婦進(jìn)行早、中孕期的篩查，對(duì)篩查高危者再進(jìn)行染色體核型分析產(chǎn)前診斷來(lái)進(jìn)一步確診[1-3]。所以G顯帶核型分析技術(shù)對(duì)提高出生人口素質(zhì)有重要的意義。G顯帶核型分析可檢測(cè)>5 Mb的染色體片段結(jié)構(gòu)異常，且具有準(zhǔn)確性高，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)。但染色體核型分析無(wú)法檢測(cè)微小變異及缺失。

2 分子細(xì)胞遺傳學(xué)分析技術(shù)（包括FISH技術(shù)和微陣列芯片雜交技術(shù)）

FISH技術(shù)是遵循堿基互補(bǔ)的原則，用標(biāo)記后的DNA作探針，然后與載玻片上待測(cè)的DNA互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)雜交位點(diǎn)熒光判讀染色體突變。FISH可直接檢測(cè)沒(méi)有經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)本是其最大的優(yōu)點(diǎn)，最短可在1 h后直接給出診斷。FISH可避免污染，可分析間期細(xì)胞，因此其培養(yǎng)失敗率低及培養(yǎng)時(shí)間短，檢測(cè)時(shí)間亦縮短。FISH檢測(cè)已知染色體異常較染色體核型分析準(zhǔn)確。FISH 技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前診斷不僅可以加快產(chǎn)前診斷的速度，而且準(zhǔn)確性高[4-5]，還可以延長(zhǎng)胎兒羊水染色體檢查在產(chǎn)前診斷中的時(shí)間窗。但FISH 因探針數(shù)目有限，只能對(duì)少數(shù)已知染色體異常進(jìn)行診斷。

微陣列芯片雜交技術(shù)是在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)染色體的微缺失和微重復(fù)，且分辨率高的一種檢測(cè)技術(shù)。它由單核苷酸多態(tài)微陣列（SNParray）和比較基因組雜交微陣列（aCGH）組成。SNParray是在基因組水平上通過(guò)微陣列檢出單個(gè)核苷酸的變異的，aCGH 是通過(guò)微陣列檢出與疾病相關(guān)的染色體異常。微陣列芯片雜交技術(shù)與前述2個(gè)檢測(cè)技術(shù)相比具有通量高、分辨率高和自動(dòng)化檢測(cè)高的優(yōu)勢(shì)，可以一次性同時(shí)檢測(cè)許多與出生缺陷和先天性疾病相關(guān)的基因組異常，近年來(lái)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于存在胎兒結(jié)構(gòu)異常的侵入性產(chǎn)前診斷[6-7]。有學(xué)者證明了微陣列芯片雜交技術(shù)在檢測(cè)胎兒染色體重組方面的效率，它顯著提高了結(jié)構(gòu)性缺陷胎兒的檢出率[8]。但微陣列芯片雜交技術(shù)只能檢測(cè)染色體數(shù)目重復(fù)或缺失，不能檢測(cè)染色體的結(jié)構(gòu)異常，價(jià)格較昂貴。它的適應(yīng)證是胎兒結(jié)構(gòu)異常，且最好先行染色體核型分析檢查。

3 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)是針對(duì)人類(lèi)染色體上具有多態(tài)性的短串聯(lián)重復(fù)序列而擴(kuò)增的，檢測(cè)出常見(jiàn)的染色體數(shù)目異常的時(shí)間可短至幾小時(shí)內(nèi)，其特點(diǎn)是快速、準(zhǔn)確、成本低、敏感性高、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，但其即使結(jié)果正常也不能排除染色體畸形，且不能檢測(cè)染色體嵌合體及易位型，這些限制了其在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用。但基因一代測(cè)序卻離不開(kāi)PCR技術(shù)的輔助作用。

4 多重連接依賴(lài)式探針擴(kuò)增技術(shù)

多重連接依賴(lài)式探針擴(kuò)增（MLPA）技術(shù)是基于 PCR 的一種檢測(cè)技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)多達(dá)50個(gè)DNA序列拷貝數(shù)的變化。是對(duì)DNA序列進(jìn)行定性及半定量分析的方法，主要用于大缺失、重復(fù)的檢測(cè)，但無(wú)法同時(shí)針對(duì)整個(gè)外顯子的DNA序列進(jìn)行檢測(cè)。故臨床上對(duì)明確致病基因的遺傳病可用MLPA技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前診斷[9-10]。

5 基因測(cè)序技術(shù)

基因測(cè)序技術(shù)是核酸DNA分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。應(yīng)用廣泛、發(fā)展迅速，已經(jīng)從第一代發(fā)展到第四代。第一代測(cè)序技術(shù)測(cè)序準(zhǔn)確性高，但通量較低，成本相對(duì)較高;第二代測(cè)序技術(shù)測(cè)序通量大大提高，是目前臨床上常用的基因測(cè)序方法;第三代測(cè)尚待完善;第四代測(cè)序技術(shù)還在實(shí)驗(yàn)階段。

5.1 第一代測(cè)序（包括化學(xué)裂解法、Sanger測(cè)序）

化學(xué)裂解法是基于PCR的DNA測(cè)序法進(jìn)行的，其原理是：先處理有標(biāo)記的DNA片段，然后特異性切割，并且產(chǎn)生降解產(chǎn)物，再經(jīng)過(guò)電泳和放射自顯影之后可讀出相應(yīng)片段DNA的核苷酸序列。此方法為最早的基因測(cè)序方法，但其操作復(fù)雜，且讀取片段短，目前很少應(yīng)用。

Sanger測(cè)序的原理是利用DNA聚合酶以待測(cè)單鏈DNA為模板，以dNTP為底物設(shè)立四種相互獨(dú)立的測(cè)序反應(yīng)體系，給每個(gè)反應(yīng)體系中加入不同ddNTP作為鏈延伸終止劑。雖然Sanger法的弊端有：離不開(kāi)PCR擴(kuò)增，只能分析單個(gè)DNA片段，通量小;自動(dòng)化程度低，檢測(cè)速度慢;成本相對(duì)較高[11]。但Sanger測(cè)序準(zhǔn)確性高，目前仍是基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)。目前Sanger測(cè)序廣泛應(yīng)用于全基因組測(cè)序及全外顯子測(cè)序的假陽(yáng)性驗(yàn)證方面。對(duì)已明確致病基因的遺傳性單基因疾病也可使用Sanger測(cè)序進(jìn)行產(chǎn)前診斷[12-13]。

5.2 第二代測(cè)序

第二代測(cè)序也叫高通量測(cè)序，其技術(shù)平臺(tái)包括三個(gè)，分別是：ABI公司的Solid測(cè)序平臺(tái)、羅氏公司454測(cè)序平臺(tái)、lllumina公司的Solexa測(cè)序平臺(tái)。三個(gè)測(cè)序平臺(tái)都有各自的優(yōu)點(diǎn)，Solid測(cè)序平臺(tái)測(cè)序較準(zhǔn)確，最大準(zhǔn)確度可達(dá)99.94%;454測(cè)序平臺(tái)的測(cè)序讀長(zhǎng)較長(zhǎng)，可達(dá)400 bp;Solexa測(cè)序平臺(tái)性?xún)r(jià)比較高，運(yùn)行成本低。第二代測(cè)序技術(shù)由于其通量大、可定量、成本低、邊合成邊測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)，其研究及應(yīng)用越來(lái)越廣泛。二代測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷（NIPT）及有創(chuàng)產(chǎn)前診斷領(lǐng)域[14-16]。在器官移植配型、腫瘤分子診斷和靶向治療及在藥物個(gè)體化治療等方面的應(yīng)用也成為熱點(diǎn)[17]。二代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于全外顯子組測(cè)序、全基因組測(cè)序、基因組重測(cè)序、從頭測(cè)序、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、小分子RNA測(cè)序等方面。其中應(yīng)用最多的是全外顯子測(cè)序，下面筆者著重?cái)⑹鋈怙@子測(cè)序技術(shù)。

于2009年在二代測(cè)序基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了全外顯子測(cè)序（WES）。WES是一種有選擇性地捕獲和排列所有帶注釋的蛋白質(zhì)編碼基因編碼區(qū)域的技術(shù)。人類(lèi)外顯子組序列僅占人類(lèi)整個(gè)基因組序列的1%，卻有85%左右的人類(lèi)致病突變包含在里面。WES的優(yōu)點(diǎn)：WES覆蓋范圍廣;測(cè)序成本低;處理時(shí)間減少。然而WES也有局限性;某些蛋白質(zhì)編碼區(qū)域可能不被覆蓋;WES沒(méi)有涵蓋潛在的功能性非編碼元素;WES檢測(cè)結(jié)構(gòu)變化的能力有限。盡管如此，WES仍然是許多研究人員選擇的工具，到目前為止通過(guò)WES已成功發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種遺傳病的致病基因[18-21]。全外顯子測(cè)序在一家族性房間隔缺損家系中檢測(cè)出TBX20（D176N）致病突變[22]。因WES技術(shù)在遺傳病中的廣泛應(yīng)用，對(duì)有遺傳病家族史的孕婦行產(chǎn)前診斷提供很好的條件。麥明秦等[23]運(yùn)用WES產(chǎn)前診斷ZMPSTE24基因突變。

5.3 第三代的測(cè)序

第三代的測(cè)序技術(shù)也稱(chēng)單分子測(cè)序技術(shù)。目前有2種，分別是利用合成測(cè)序理論測(cè)序的Helisope BioScience公司的SMS技術(shù)和以SMRT芯片為測(cè)序載體進(jìn)行的邊合成邊測(cè)序技術(shù)的Pacific Bioscience的SMRT技術(shù)[11]。第三代測(cè)序?yàn)閱畏肿訙y(cè)序，不需進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第三代測(cè)序方法的優(yōu)點(diǎn)為：（1）更高通量;（2）更短測(cè)序時(shí)間;（3）更長(zhǎng)讀取長(zhǎng)度;（4）更高精確性，可以檢測(cè)出極少的變異;（5）需要很少起始量;（6）更低的成本。當(dāng)然其也有缺點(diǎn)：（1）很難保持酶的活性與穩(wěn)定性;（2）很難在提高單分子信號(hào)靈敏度同時(shí)又不會(huì)把信號(hào)變成噪音增加熒光背景;（3）很難保持DNA的延展性而又不出現(xiàn)二聚體結(jié)構(gòu)等。因?yàn)槌L(zhǎng)的讀取長(zhǎng)度[24]，單分子測(cè)序技術(shù)前景廣闊，其可以在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用被廣泛關(guān)注。2017年11月6日經(jīng)濟(jì)日?qǐng)?bào)刊登了一例第三代單分子基因測(cè)序儀成功應(yīng)用于無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（NIPT）的報(bào)道。第三代單分子基因檢測(cè)技術(shù)有望在不久后應(yīng)用于產(chǎn)前診斷方面，在基因檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮更大作用。

5.4 第四代測(cè)序

第四代測(cè)序技術(shù)為納米孔測(cè)序技術(shù)，它改變了傳統(tǒng)的方法即序列讀取需要在復(fù)雜的酶促反應(yīng)中進(jìn)行，而是通過(guò)力學(xué)、電學(xué)等對(duì)DNA分子中的堿基直接判讀，但其尚處于研究當(dāng)中。其中代表性的方法是Nanopores測(cè)序法，它是一種基于電信號(hào)測(cè)序的新型技術(shù)。第四代測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)有：操作簡(jiǎn)單、成本低、快速[25]。雖然目前第四代測(cè)序技術(shù)尚處于研究中，還不完善，但有望在不久的將來(lái)人們能利用其以最快的速度得到人類(lèi)基因組信息，并期望其能用于產(chǎn)前診斷領(lǐng)域，為優(yōu)生優(yōu)育事業(yè) 做貢獻(xiàn)。

6 小結(jié)與展望

綜上所述，產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速，科技的發(fā)展推動(dòng)著產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)已從20世紀(jì)60年代的染色體核型分析發(fā)展到現(xiàn)在的基因測(cè)序，是朝著更快速、準(zhǔn)確、方便、經(jīng)濟(jì)的方向發(fā)展。各種產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，各有其適用范圍。目前染色體核型分析仍然是產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)胎兒存在結(jié)構(gòu)異常時(shí)可加做微陣列芯片雜交等，近年來(lái)基因測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，其中二代測(cè)序近年來(lái)發(fā)展尤為迅速，其在遺傳性單基因疾病的產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用及植入前產(chǎn)前診斷的應(yīng)用越來(lái)越被重視。產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展對(duì)防控出生缺陷及提高人口素質(zhì)有重要意義。

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