趙江濤，張 偉，吳吉海，徐文軒，王美祺，陳 靖

(1.保定市第四中心醫(yī)院外科，河北 保定 072350； 2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺外科，石家莊 050011；3.天津市腫瘤醫(yī)院胰腺腫瘤科，天津 300060)

乳腺癌是全世界女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，有4種亞型，分別為luminal A型、luminal B型、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)過表達(dá)型和Basal-like型[1-3]。HER2過表達(dá)型的乳腺癌攻擊性較強(qiáng)，雖然目前關(guān)于HER2過表達(dá)型乳腺癌的治療取得了一定進(jìn)展，但患者往往預(yù)后較差，生存期較短[4-8]。近年來靶向治療在該病的治療中顯示出良好的前景，相關(guān)的幾種靶向藥物均取得了較好的臨床效果[9-11]。而為了獲得更好的臨床療效，對(duì)于HER2過表達(dá)型的乳腺癌目前仍迫切需要新的治療靶點(diǎn)。

腺苷酸激酶(adenylate kinases，AK)是一類涉及多種細(xì)胞功能的核苷單磷酸鹽激酶[12-13]。AK4是AK家族的成員[14]。既往研究表明，AK4與細(xì)胞的增殖和存活相關(guān)[15-16]。已有研究報(bào)道，AK家族參與多種癌癥的進(jìn)展[17]。AK4在肺癌、食管癌等侵襲性很強(qiáng)的腫瘤中明顯過表達(dá)，并且AK4參與調(diào)控缺氧耐受和線粒體活性，進(jìn)一步影響腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[17-19]。AK4介導(dǎo)相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)一步促進(jìn)膠質(zhì)瘤患者的生存，提示其可能影響膠質(zhì)瘤的進(jìn)展[20]。盡管AK4廣泛參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但AK4在HER2過表達(dá)型乳腺癌中的作用和機(jī)制尚不清楚。本研究主要探討AK4在HER2過表達(dá)型乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義，以期為HER2過表達(dá)型乳腺癌患者的靶向治療提供一定的臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2010年3月至2018年11月保定市第四中心醫(yī)院收治的接受乳腺癌根治性切除手術(shù)治療的82例HER2過表達(dá)型乳腺癌患者的臨床病理資料。所有患者均經(jīng)病理證實(shí)，患者術(shù)前未行放化療等輔助治療,術(shù)后均應(yīng)用輔助治療手段控制腫瘤進(jìn)展，均給予環(huán)磷酰胺聯(lián)合表柔比星進(jìn)行化療?；颊吣挲g40～60歲，平均(51±5)歲，其中<50歲者42例，≥50歲者40例；腫瘤分級(jí)：低級(jí)別46例，高級(jí)別36例；腫瘤大小：<2 cm者48例，≥2 cm者34例；腫瘤pTNM分期：Ⅰ～Ⅱ期54例，Ⅲ～Ⅳ期28例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例；脈管內(nèi)瘤栓34例。隨訪以電話和查閱病歷的方式進(jìn)行。隨訪起始時(shí)間為手術(shù)時(shí)間結(jié)束當(dāng)日，隨訪截止時(shí)間為2018年11月或患者死亡時(shí)間。

1.2組織和試劑 82例HER2過表達(dá)型乳腺癌患者根治性手術(shù)切除的腫瘤和癌旁正常組織(距離腫瘤組織3～5 mm處的乳腺正常組織)標(biāo)本。AK4抗體為兔抗人多克隆抗體，購自英國Abcam公司(Catalog No:ab131327)，稀釋濃度為1∶200，免疫組織化學(xué)二步法檢測試劑盒購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司(PV-6001，通用型二抗)。

1.3免疫組織化學(xué)法 采用10%的甲醛固定乳腺癌腫瘤組織，并進(jìn)行石蠟包埋與切片。切片于75 ℃加熱30 min，隨后用二甲苯脫蠟，并用梯度乙醇(100%，100%，95%，85%，75%)水合。隨后用檸檬酸緩沖液孵育15 min提取抗原，并阻斷內(nèi)源性過氧化物酶5 min，5%小牛封閉血清封閉切片20 min，隨后使用抗AK4的抗體孵育2 h。然后切片用生物素化的二抗(1∶1 000稀釋，武漢三鷹公司)孵育1.5 h，氧化二氨基聯(lián)苯胺(上海Cell Signaling Technology公司)作為顯色劑底物，洗滌染色5 min后用顯微鏡(日本尼康E200生物顯微鏡)采集圖像。

1.4免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定 AK4蛋白腫瘤細(xì)胞陽性率<5%記為0分，5%～25%記為1分，>25%～75%記為2分，>75%記為3分。同時(shí)對(duì)陽性染色的腫瘤細(xì)胞的膜及胞質(zhì)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分:陰性染色記為0分，弱陽性染色記為1分，中度陽性染色記為2分，強(qiáng)陽性染色記為3分。隨后將陽性細(xì)胞百分比的評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分相加，分為高表達(dá)(3～6分)和低表達(dá)(<3分)。每例患者的腫瘤組織切片選取5個(gè)視野觀察，分析陽性率和染色強(qiáng)度，最終結(jié)果采用雙盲法進(jìn)行判斷。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad prism 5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)比較總生存率和無病生存率。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1AK4在HER2過表達(dá)型乳腺癌組織中的表達(dá) AK4主要表達(dá)于乳腺癌癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒狀。AK4在HER2過表達(dá)型乳腺癌組織中的陽性高表達(dá)率為63.4%(52/82)，免疫組織化學(xué)的染色結(jié)果見圖1A。82例癌旁組織中未見AK4的陽性高表達(dá)，見圖1B。

2.2HER2過表達(dá)型乳腺癌組織AK4的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 pTNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的HER2過表達(dá)型乳腺癌AK4高表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期,有轉(zhuǎn)移的HER2過表達(dá)型乳腺癌AK4高表達(dá)率高于無轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，不同年齡、腫瘤分級(jí)、腫瘤大小及有無脈管瘤栓的AK4高表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 82例HER2過表達(dá)型乳腺癌患者中AK4表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 [例(%)]

HER2：人類表皮生長因子受體2； AK4：腺苷酸激酶4

2.3生存分析 高表達(dá)組和低表達(dá)組的中位總生存時(shí)間分別為48.2和59.0個(gè)月，中位無病生存時(shí)間分別為39.3和100個(gè)月，AK4高表達(dá)的HER2過表達(dá)型乳腺癌患者術(shù)后中位生存期短于AK4低表達(dá)者(總生存率:χ2=4.891，P=0.021；無病生存率：χ2=6.014，P=0.016)。見圖2。

3 討 論

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織中的一種惡性腫瘤，約99%的乳腺癌發(fā)生在女性[1-2]。乳腺癌可以在包括小葉在內(nèi)的乳腺多個(gè)部位發(fā)生，如果腫瘤進(jìn)一步侵襲則會(huì)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移到身體的其他部位[1-3]。乳腺癌的4種亞型分別為luminal A型：雌激素受體(+)和(或)孕激素受體(+)、HER-2(-)、Ki-67(-)；luminal B型雌激素受體(+)和(或)孕激素受體(+)、HER-2(-)、Ki-67(+)；HER-2過度表達(dá)型：雌激素受體(-)和(或)孕激素受體(-)，HER-2(+)；三陰性即Basal-like型：雌激素受體(-)、孕激素受體(-)、HER-2(-)[3]。HER-2過表達(dá)型乳腺癌是乳腺癌的一種亞型，由于細(xì)胞異質(zhì)性、腫瘤易轉(zhuǎn)移和分子機(jī)制的復(fù)雜性而導(dǎo)致預(yù)后不良[4-6]。HER-2過表達(dá)型乳腺癌的傳統(tǒng)治療還依賴于芳香化酶抑制劑和抗雌激素[7-8]。雖然針對(duì)其傳統(tǒng)治療取得了一定進(jìn)展，但總體療效仍欠佳[4-11]。近年來越來越多針對(duì)HER-2過表達(dá)型乳腺癌的研究正在開展，目的在于發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[7-8]。HER-2是乳腺癌的重要預(yù)后因子，HER-2陽性(過表達(dá)或擴(kuò)增)乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與其他亞型乳腺癌不同，治療方法也不同[21-22]。近年來，靶向治療對(duì)該腫瘤有較好的療效[23-24]。注射用曲妥珠單抗和拉帕替尼等靶向藥物特異性靶向HER-2基因，對(duì)早期和晚期(轉(zhuǎn)移性)HER-2陽性乳腺癌均有效[25-26]。雖然HER-2是乳腺癌的驅(qū)動(dòng)基因，但仍有一些基因參與HER-2陽性乳腺癌的進(jìn)展。作為潛在的治療靶點(diǎn)，有必要開發(fā)相關(guān)靶向藥物，參與聯(lián)合治療，以改善HER-2過表達(dá)乳腺癌患者的預(yù)后[27]。

AK4：腺苷酸激酶4；HER-2：人類表皮生長因子受體2圖2 HER-2過表達(dá)型乳腺癌中AK4高低表達(dá)的總生存期(2a)和無病生存期(2b)比較

AK是一類涉及多種細(xì)胞功能的核苷單磷酸鹽激酶，AK4是腺苷酸激酶家族的成員。既往體外研究結(jié)果表明，AK4能與ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活[15-16]。已有研究報(bào)道，AK4在肺癌、食管癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤中存在過表達(dá)現(xiàn)象，可能進(jìn)一步影響腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[17-20]。本研究結(jié)果顯示AK4在腫瘤組織中高表達(dá)，且與患者的臨床特征相關(guān)。因此，AK4可以作為治療HER-2過表達(dá)型乳腺癌的新靶點(diǎn)。

既往研究證實(shí)，AK4在肺癌中的異常高表達(dá)與肺癌的分期較晚、容易復(fù)發(fā)及預(yù)后不良有關(guān)[19]。本研究結(jié)果也顯示，乳腺癌腫瘤組織中AK4表達(dá)量較高，且AK4的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期相關(guān)。這些臨床分析結(jié)果證實(shí)AK4在HER-2過表達(dá)型乳腺癌進(jìn)展中的潛在作用。同樣，先前的研究表明AK4在腫瘤發(fā)生過程中扮演促癌因子的角色，AK4在多種癌細(xì)胞中高表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和侵襲[17-18]。在HER-2過表達(dá)型乳腺癌中AK4能否促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和侵襲需要進(jìn)一步研究和證實(shí)。此外，有研究證實(shí)，AK4通過依賴于轉(zhuǎn)錄激活因子3的方式促進(jìn)肺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[19]，而轉(zhuǎn)錄激活因子3參與不同腫瘤生長的作用已廣泛證實(shí)[28]。轉(zhuǎn)錄激活因子3參與乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[29-30]。因此，可以提出假說，在HER-2過表達(dá)型乳腺癌中可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活因子3促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲，這也是下一步需要進(jìn)行的機(jī)制層面的研究。

綜上所述，HER-2過表達(dá)型乳腺癌的惡性程度較高，預(yù)后較差。AK4在HER-2過表達(dá)型乳腺癌中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，且其異常高表達(dá)提示HER-2過表達(dá)型乳腺癌患者的TNM高分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)示不良的預(yù)后。因此，AK4可能是HER-2過表達(dá)型乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。