郭丹 楊建偉 楊亮 石科

肺癌是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率較高［1-2］，因此尋找有效的肺癌診斷方法具有重要的意義。功能基因的異常高甲基化發(fā)生在腫瘤的較早階段，是腫瘤細胞的一個重要的分子特征，因此可以作為腫瘤早期診斷的分子標志物［3-4］。腫瘤DNA 在細胞自然死亡后被釋放到血液或體液中，這些循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）不僅攜帶著腫瘤細胞的遺傳信息，并且保持著表觀遺傳學(xué)上的變化［5］。因此，血漿基因甲基化檢測對肺癌診斷具有一定的臨床價值。

同源盒基因（homeobox，HOX）是編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因家族，對胚胎的發(fā)育具有非常重要的作用。在肺癌和其他類型的腫瘤中，HOX 基因是CpG 島甲基化的研究熱點［6］。HOX 基因家族無論在肺癌細胞系、鱗狀Ⅰ期腫瘤，還是混合期腫瘤中都普遍存在甲基化［7］。癌癥基因組圖譜（TCGA）研究發(fā)現(xiàn)HOXA7在肺鱗癌和腺癌組織中存在非常普遍的DNA 甲基化，但在正常的肺組織中卻尚未發(fā)現(xiàn)［8］。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）Ⅰ期和ⅡA 期患者的血漿和痰液中都檢測到HOXA7 基因甲基化［9］。但HOXA7基因甲基化在診斷NSCLC中的價值尚不清楚。此外，關(guān)于血漿HOXA7 基因甲基化和其他肺癌診斷標志物相關(guān)性的研究鮮見報道。因此，本研究通過檢測NSCLC 患者血漿中HOXA7 基因甲基化水平，探討HOXA7 基因甲基化水平與肺癌診斷標志物、肺癌類型、TNM 分期的關(guān)系，旨在闡明血漿HOXA7甲基化在NSCLC臨床鑒別診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取河南省腫瘤醫(yī)院2012年1月至2016年12月80例住院的經(jīng)病理組織學(xué)確診為NSCLC患者為試驗組，50例健康人為對照組。入選標準：1）無肺部手術(shù)治療史；2）未經(jīng)肺癌任何相關(guān)化療、免疫治療等；3）肺癌為原發(fā)性腫瘤并無其他腫瘤病史。入選肺癌患者和健康人群的基本資料見表1，本研究經(jīng)河南鄭州大學(xué)倫理委員會批準，并獲得患者家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤標志物檢測 采取患者手術(shù)前空腹外周靜脈血5 mL，3 000 r/min 離心10 min 取上清液，參照Elecsys 2010電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套的測定試盒（上海羅氏有限公司）使用說明書，使用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細胞角蛋白19 片段抗原21-1（cytokeratin 19 fragment antigen 21-1，cyfra21-1）和糖類抗原（carbohydrate antigen 199，CA199）水平。

1.2.2 血漿DNA 提取和修飾 抽取患者手術(shù)前空腹外周靜脈血10 mL于EDTA 抗凝血管中，立即進行3 000 r/min 離心10 min 分離血漿，使用QIAamp DNA Mini Kit（德國QIAGEN 公司）分離血漿DNA，Nanodrop100 核酸定量分析儀（美國Thermo 公司）測定DNA 的純度和濃度，要求所提DNA 的A260/A280在1.7～1.9 之間。使用EZ DNA Methylation-Gold 試劑盒（美國ZYMO公司）對所提取DNA進行亞硫酸氫鈉修飾備用。

表1 肺癌患者和健康人群的基本資料 n（%）

1.2.3 HOXA7 基因甲基化的qMSP 分析 采用定量甲基化特異PCR（quantitative methylation-specific PCR，qMSP）檢測患者ctDNA 中HOXA7 基因甲基化水平，引物和探針序列見表2。每個反應(yīng)體系為25 μL，包括2 μL亞硫酸修飾后的DNA、300 nmol/L正向引物和反向引物、100 nmol/L探針、100 nmol/L熒光染料、1.67 mmol/L dNTPs 和1 mL Platinum Taq DNA 聚合酶（美國Invitrogen 公司）。在96 孔板中每個樣本重復(fù)3 次。反應(yīng)條件為95℃5 min，95℃15 sec，65℃1 min，72℃1 min，共50個循環(huán)在Step One Plus Real-Time PCR儀（美國Applied BioSystems公司）上進行擴增。HOXA7的甲基化水平的計算采用2-ΔCT表示［9］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。構(gòu)建受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算AUC 值用于評估各指標在診斷肺癌中的性能，并計算cutoff值，統(tǒng)計各指標診斷肺癌的靈敏度和特異度。兩組之間HOXA7甲基化差異分析用χ2檢驗。Pearson相關(guān)性分析對肺癌組織中各指標之間的相關(guān)性。用Medcalc 軟件中的Delong 法對不同指標檢測NSCLC 的ROC 曲線進行統(tǒng)計學(xué)分析。以P＞0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 引物和探針序列

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者血漿中HOXA7啟動子甲基化檢測

通過qMSP 檢測NSCLC 患者和健康人群血漿中HOXA7基因啟動子甲基化水平，經(jīng)ROC曲線分析顯示，AUC為0.813，95%CI為0.741～0.884，根據(jù)ROC制定診斷界值，采用約登指數(shù)最大法得到cutoff 值為2.308，HOXA7甲基化診斷NSCLC的敏感度為68.8%（55/80），特異度為86.0%（43/50）。與健康對照組相比，NSCLC患者血漿中發(fā)現(xiàn)更高的HOXA7 DNA甲基化水平，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=36.972，P＜0.000 1，圖1）。

圖1 血漿HOXA7基因啟動子甲基化水平

2.2 血漿HOXA7甲基化與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

NSCLC 患者血漿HOXA7 甲基化與性別、年齡和有無吸煙史無關(guān)（均P＞0.05，表3），血漿HOXA7甲基化水平在鱗癌患者為71.8%（28/39），腺癌患者為65.9%（27/41），兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但HOXA7甲基化與TNM 分期有關(guān)（P＜0.05），其中Ⅳ期患者血漿HOXA7 甲基化水平最高為81.8%（18/22），為Ⅲ期68.6%（24/35）、Ⅱ期67.4%（11/17）和Ⅰ期11.1%（1/9）。

2.3 血漿HOXA7甲基化和腫瘤標志物的相關(guān)性分析

經(jīng)分析HOXA7 甲基化與Cyfra21-1 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（r=0.564，P＜0.05）。但HOXA7 甲基化與CA199 和CEA 的相關(guān)系數(shù)分別為0.202（P＜0.05）和-0.060（P＞0.05），說明HOXA7 甲基化與Cyfra21-1 之間的相關(guān)性較好。

表3 血漿HOXA7甲基化與臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析

2.4 血漿HOXA7甲基化聯(lián)合腫瘤標志物檢測NSCLC的診斷價值

對3種血清腫瘤標志物進行了ROC曲線分析（圖2，表4），AUC值從高到低分別為Cyfra21-1（0.786）、CEA（0.662）和CA199（0.522），其中Cyfra21-1診斷NSCLC的敏感度為70.00%，特異度為90.00%。與3種血清腫瘤標志物相比，HOXA7 甲基化的診斷價值最高（AUC=0.813）。經(jīng)Medcalc軟件分析顯示，HOXA7甲基化的AUC與Cyfra21-1相比無顯著性差異（P＞0.05），而與CA199和CEA相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

CEA+CA199+Cyfra21-1三指標聯(lián)合診斷NSCLC的AUC為0.810，敏感度為65.00%，特異度為94.00%。CEA+CA199+HOXA7甲基化聯(lián)合診斷NSCLC的敏感度最高為76.25%，Cyfra21-1+HOXA7甲基化聯(lián)合診斷NSCLC的特異度最高為96.00%。HOXA7甲基化聯(lián)合三指標（四指標聯(lián)合）診斷NSCLC的效能最高，AUC為0.893，敏感度和特異度分別為73.75%和94.00%。

表4 血漿中3種腫瘤標志物和HOXA7甲基化對NSCLC的診斷價值評估

3 討論

肺組織的血管豐富，與外周血液循環(huán)的具有緊密聯(lián)系，所以ctDNA水平和分子特征在肺癌診斷中起著重要的作用。研究顯示，肺癌患者的ctDNA水平比正常人高［10］。肺癌組織DNA和血清ctDNA中癌基因和抑癌基因的改變具有高度的一致性［11］，說明檢測ctDNA 中特殊分子的改變可以作為一種非侵入性的手段診斷腫瘤，其中研究最多的是基因甲基化［10］。

HOX 基因參與個體發(fā)育和細胞分化，在胚胎發(fā)育中決定身體節(jié)段邊界。HOX基因通過調(diào)節(jié)下游基因的表達，影響細胞的多種生物學(xué)功能，如增殖、生存、遷移、分化以及血管的生成［12］。HOX基因家族包括A、B、C和D四個亞族。研究表明，HOXA家族基因在NSCLC 中表達下降，有可能是通過基因甲基化導(dǎo)致的表達下調(diào)［6］。HOXA 基因在多種腫瘤中表達異常，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如FGF、Wnt、RA 等，與腫瘤的分期和預(yù)后有關(guān)［13］，其中HOXA7 已成為急性髓性白血病生存率差的預(yù)測因子之一［14］，且在早期的肺腺癌和鱗癌組織中普遍都存在HOXA7 基因甲基化［7］，對原發(fā)性肺鱗狀細胞癌中HOXA基因的甲基化分析發(fā)現(xiàn)，HOXA7相關(guān)的CpG島是I期腫瘤中常見的甲基化靶點，肺癌組織中有45.00%HOXA7 CpG 島發(fā)生甲基化［6］。

本研究結(jié)果表明，NSCLC 患者血漿中HOXA7 甲基化水平明顯高于健康人，與文獻報道一致［15］。Hulbert 等［9］報道NSCLC 患者痰液中HOXA7甲基化的診斷效率較高，AUC 為0.77，敏感度和特異度分別為63.00%和92.00%。本研究中血漿HOXA7 甲基化診斷NSCLC 的AUC 為0.813，敏感度和特異度分別為68.80%和86.00%。此外，本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者血漿HOXA7甲基化與性別、年齡、有無吸煙史和病理類型均無關(guān)（P＞0.05），但與TNM 分期有關(guān)（P＜0.05），從Ⅰ期到Ⅳ期NSCLC患者血漿HOXA7甲基化水平逐漸升高，其中Ⅳ期患者血漿HOXA7 甲基化水平達81.80%（18/22），說明血漿HOXA7甲基化水平與NSCLC的惡性程度有關(guān)，參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展。

檢測血清中腫瘤標志物的水平因具有快捷、靈敏度高的優(yōu)點而被廣泛用于臨床，肺癌標志物有CEA、CA199、Cyfra21-1 等。研究表明，在NSCLC 和SCLC 患者血清中都發(fā)現(xiàn)異常高水平的CEA［16-17］，Liu等［18］報道Cyfra21-1是NSCLC 最靈敏的標志物，治療前Cyfra21-1 水平可以作為SCLC 患者預(yù)后差的指標。CEA 和CYFRA 21-1 是診斷肺癌的可靠血清腫瘤標志物［19］。本研究結(jié)果顯示，Cyfra21-1 診斷NSCLC 的AUC 值最大，敏感度和特異度分別為70.00%和90.00%，CEA 診斷NSCLC 的敏感度和特異度分別為42.50%和72.00%。Okamura 等［20］報道，Cyfra21-1的敏感度和特異度分別為43.00%和89.00%，CEA 診斷肺癌的敏感度和特異度分別為69.00%和68.00%，本研究所用的樣本為NSCLC患者血清，說明Cyfra21-1 在診斷NSCLC 有更高的敏感度。此外，本研究結(jié)果中CA199 診斷NSCLC 的敏感度較低，僅為23.75%，與Okamura等文獻報道一致。

多項腫瘤標志物的聯(lián)合檢測能夠提高檢測效率［21］，本研究對Cyfra21-1、CA199、CEA 腫瘤標志物聯(lián)合診斷進行分析發(fā)現(xiàn)，NSCLC 的AUC 值增高0.810，敏感度下降至65%，特異度增高至94%。當(dāng)增加HOXA7甲基化檢測指標后，診斷NSCLC的效能最高，AUC 為0.893，敏感度和特異度達73.75%和94%。此外，HOXA7 甲基化與Cyfra21-1 水平具有相關(guān)性，說明HOXA7 甲基化可以作為NSCLC 標志物，并且可以提高血清腫瘤標志物診斷的敏感度。

本研究表明，在血漿中檢測HOXA7 基因啟動子甲基化可獲得較高的早期診斷NSCLC 準確性，HOXA7 甲基化和惡性程度相關(guān)，聯(lián)合腫瘤標志物檢測可以提高NSCLC的診斷效能。本研究仍需擴大樣本量以保證結(jié)論的科學(xué)性，相信檢測血漿基因甲基化可作為CT篩查的輔助工具，識別肺癌高?；颊?，減少假陽性結(jié)果，減少不必要的檢測，提高肺癌早期診斷水平。