楊壽慧1，劉惟優(yōu)，吳龍火3，袁小亮

結核病(Tuberculosis，TB)長期以來威脅著人類的健康，世界衛(wèi)生組估計2015年全世界約有1 040萬新發(fā)結核病例，且約有48萬新發(fā)耐多藥結核(multidrug-resistant，MDR)病例，我國新發(fā)肺結核人數(shù)僅次于印度和印度尼西亞而位居全球第3位[1]。異煙肼(isoniazid，INH)是結核病治療的首選化學藥物。然而，隨著INH廣泛用于臨床，其耐藥情況不容忽視，據(jù)2010年全國第5次結核病流行病學抽樣調(diào)查報告[2]，我國結核病患者對INH的耐藥率最高(28.6%)。這一嚴峻的形勢迫使人們尋求更加快速、準確的INH耐藥結核檢測方法，以便更有效的控制結核病。

目前認為，katG基因(編碼過氧化氫-過氧化物酶)是最重要的INH耐藥基因，其突變存在于50%～70%的耐INH結核菌株中[3]。故katG基因突變檢測已成為早期判斷耐INH結核菌的重要手段。而katGAGC315ACC(Ser315Thr)突變是katG基因最常見的突變類型[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)來自江西地區(qū)的一臨床分離結核菌株對INH表現(xiàn)高度耐藥，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)此菌株在katG基因含有唯一突變點ACT271CCT(GenBank登錄號：JN049496)，但該突變點與INH耐藥關系尚無相關研究報道[5]。本研究采用katG蛋白酶活性檢測及分子對接方法分析該突變點與INH耐藥的關系，以期通過檢測發(fā)現(xiàn)該位點基因突變與結核菌株表型耐藥關系。

1 材料與方法

1.1菌株和質(zhì)粒 結核分枝桿菌katG(ACT271CCT)、katG野生型、katG(AGC315ACC)基因片段由上海生工生物工程合成，BL21(DE3)pLySs贛南醫(yī)學院基礎醫(yī)學院科研中心保存。質(zhì)粒pET-22b(+)購自武漢淼靈生物科技有限公司。

1.2主要試劑 酵母粉、胰蛋白胨購自英國OXOID公司，HisTrap FF-crude購自GE公司，氨芐青霉素、Anti-His antibody、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG、過氧化氫酶(catalase, CAT)檢測試劑盒及過氧化物酶試劑盒(peroxidase, POD)購自索萊寶科技有限公司。PageRulerTMPrestained Protein ladder購自Thermo Fisher公司。

1.3 結核分枝桿菌katG表達及提純

1.3.1原核表達載體的構建 katG野生型、katG(ACT271CCT)、katG(AGC315ACC)基因片段和載體pET-22b(+)分別用EcoRⅠ和HindⅢ進行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)DNA連接酶與載體pET-22b(+)連接。

1.3.2katG重組蛋白誘導表達條件摸索 將各重組質(zhì)粒及pET-22b(+)轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)pLySs感受態(tài)，接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的SOB平板，經(jīng)37 ℃過夜培養(yǎng)。無菌條件下挑取轉(zhuǎn)化陽性單克隆菌接種于SOB培養(yǎng)液中，待A600值約為0.6 時，按1∶100轉(zhuǎn)接至新的SOB培養(yǎng)液中。取野生型培養(yǎng)重組質(zhì)粒菌液培養(yǎng)3～5 h后，摸索不同IPTG濃度、溫度、時間、培養(yǎng)液濃度下蛋白誘導表達最佳條件。

1.3.3katG重組蛋白原核表達及Western blot鑒定 按蛋白誘導表達最佳條件，分別誘導katG野生型、katG(ACT271CCT)、katG(AGC315ACC)重組質(zhì)粒菌，次日蛋白表達充分后，分別取等量菌液離心，用電泳液重懸菌體，行SDS-PAGE電泳及Western blot鑒定。Western blot一抗為Anti-His antibody，二抗為辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG，采用辣根過氧化物酶法(HRP)顯色。

1.3.4katG重組蛋白分離、純化 分別重新從SOB平板上挑取各自單克隆菌，接種于10 mL SOB培養(yǎng)液中，過夜培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接至新的500 mL SOB培養(yǎng)液中，過夜誘導蛋白表達。收集菌體，用20 mL 20 mmol/L PBS+10 mmol/L咪唑平衡緩沖液重懸。菌液加入溶菌酶(工作濃度0.2～0.4 mg/mL)，超聲破碎儀破菌，10 000 r/min 4 ℃ 20～30 min分離上清和沉淀，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，分析超聲破碎后katG重組蛋白分布情況。

將HisTrap FF-crude柱用20 mmol/LBS沖洗酒精后，用20 mmol/L PBS+10 mmol/L咪唑平衡緩沖液平衡5個柱長體積，將超破后上清以1 mL/min通過柱子，過柱2遍，使目的蛋白與柱子充分結合，收集流出液，分別用含20、40、100、250 mmol/L咪唑緩沖液依次洗脫His標簽純化樹脂，收集各組洗脫液進行SDS-PAGE電泳，分析katG重組蛋白純化情況。將重組蛋白液加入透析袋中，置于透析液中4 ℃過夜透析。

1.3.5katG重組蛋白定量及活性測定 用BCA蛋白定量法檢測katG重組純化蛋白濃度。按過氧化氫酶試劑盒說明書比例混合好工作液，在1 000 μL過氧化氫酶反應體系中加入100 μL重組蛋白，紫外分光光度計240 nm測定初使吸光值A1和1 min后的吸光值A2。ΔA=A1-A2，計算katG重組蛋白過氧化氫酶活性(U/mg prot)=678×ΔA÷蛋白濃度。按過氧化物酶試劑盒說明書比例混合好工作液，在1 000 μL過氧化物酶反應體系中加入100 μL重組蛋白，分光光度劑470 nm檢測加入重組蛋白30 s 時的吸光值 A1和 90s 時吸光值 A2, ΔA=A2-A1,計算katG重組蛋白過氧化物酶活性(U/mg prot)=7 133×ΔA÷蛋白濃度。

1.4分子對接 野生型結核分枝桿菌katG蛋白的晶體結構從蛋白晶體結構數(shù)據(jù)庫 (http://www.rcsb.org)獲得(PDB ID：1SJ2)，使用Autodock Tools對受體蛋白質(zhì)結構進行處理，保留其氧化反應中心含鐵的卟啉環(huán)，刪除底物小分子，加極性氫，加原子電荷。其他突變體均在野生型的基礎上通過YASARA軟件進行突變?nèi)缓笫褂米疃赶陆捣▋?yōu)化1 000次選擇自由能最小的構象建立katG蛋白三維模型。

異煙肼的三維結構從PubChem compound數(shù)據(jù)庫(ID：3767)獲取，將上述的小分子結構使用分子力場方法優(yōu)化，并加上Gaisteiger電荷，作為對接配體存為pdbqt文件。然后對小分子和受體進行分子對接，所有對接均使用Autodock 4.2軟件包完成，利用拉馬克遺傳算法(Lamarckian Genetic Algorithm)確定katG 蛋白和異煙肼最佳結合構象,對接結果保留10個能量最低的構象并進行簇(cluster)分析。參考氧化活性中心卟啉環(huán)的位置，對接的 BOX位于卟啉上方的空腔內(nèi)，中心坐標為45.47,-3.905, 28.640，大小為 40埃×40?！?0埃，其余采用軟件的默認值。

2 結 果

2.1 katG蛋白表達、純化及酶活性檢測

2.1.1katG蛋白表達條件摸索 結核分枝桿菌katG野生型重組基因轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)pLySs，摸索不同溫度、不同濃度IPTG、不同濃度培養(yǎng)基，IPTG誘導katG蛋白表達最佳條件?？梢钥闯鯥PTG 0.5 mmol/L、20 ℃、12 h在2×SOB培養(yǎng)基條件下誘導出目的蛋白濃度最佳(圖1、2)。

M：蛋白分子質(zhì)量標準；1：未加IPTG、28 ℃、12 h；2：IPTG 0.5 mmol/L、20 ℃、12 h；3：IPTG 0.5 mmol/L、25 ℃、12 h；4：IPTG 0.5 mmol/L、28 ℃、12 h；5：IPTG 1 mmol/L、28 ℃、12 h。圖1 IPTG濃度、時間、溫度的摸索Fig.1 Exploration of IPTG concentration，induction time and temperature

M：蛋白分子質(zhì)量標準；1：未轉(zhuǎn)質(zhì)粒大腸桿菌；2：轉(zhuǎn)質(zhì)粒菌體誘導于1×SOB培養(yǎng)基；3：轉(zhuǎn)質(zhì)粒菌體誘導于1.5×SOB培養(yǎng)基；4：轉(zhuǎn)質(zhì)粒菌體誘導于2×SOB培養(yǎng)基。圖2 培養(yǎng)基濃度的摸索Fig.2 Exploration of medium concentration

2.1.2katG重組蛋白原核表達及Western blot鑒定 結核分枝桿菌katG野生型、katG(ACT271CCT)、katG(AGC315ACC)重組基因轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)pLySs，IPTG誘導重組基因蛋白表達，重組蛋白分子量約為85 kd，SDS-PAGE檢測誘導前后蛋白表達情況(圖3)。Western blot顯示含有6×His標簽的重組蛋白能被Anti-His antibody識別(圖4)。

2.1.3超聲破碎重組蛋白大腸桿菌 重組基因菌體超聲破碎后katG蛋白分布情況可見katG蛋白分布于上清中(圖5)。

2.1.4katG重組蛋白的純化 重組菌超聲破碎上清液過HisTrap FF-crude柱，不同濃度咪唑洗脫緩沖液洗脫后檢測，其中100 mmol/L咪唑洗脫緩沖液得到純化katG重組蛋白(圖6)。

2.1.5katG重組蛋白酶活性測定 測得katG(ACT271CCT)、katG野生型、katG(AGC315ACC)重組蛋白過氧化氫酶和過氧化物酶活性，見表1和圖7。

M：蛋白分子質(zhì)量標準；1：katG蛋白野生型未誘導；2：katG蛋白271突變未誘導；3：katG蛋白315突變未誘導；4：katG蛋白野生型誘導后；5：katG蛋白271突變誘導后；6：katG蛋白315突變誘導后。圖3 重組表達宿主菌誘導前后重組蛋白katG的表達Fig.3 Recombinant protein katG expression before and after induction

1:空載體；2：katG野生型蛋白；3：katG271突變型；4：katG315突變型。圖4 katG重組蛋白Western blot鑒定Fig.4 Identification of recombinant protein katG by Western blot

M: 蛋白分子質(zhì)量標準；1：超聲破碎后上清；2：超聲破碎后沉淀。圖5 菌體超聲破碎后katG蛋白分布Fig.5 Distribution of katG protein after ultrasoniction

圖6 鎳親和層析純化的野生型katG蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE profile of wild-type katG purified by affinity chromatography

表1 katG重組蛋白的過氧化氫酶和過氧化物酶活性
Tab.1 Catalase and peroxidase activities of recombinant protein katGs

katG重組蛋白類型 過氧化氫酶比活(U /mg)過氧化物酶比活(U /mg)野生型361.577.6katG271突變型158.8(↓56%)28.7(↓63%)katG315突變型92.6(↓74%)19.7(↓75%)

注：1U過氧化氫酶為25 ℃、pH=7.0條件下，1 min內(nèi)催化1 μmoL H2O2反應所需的酶量；1U過氧化物酶為25 ℃、pH7.0條件下，1 min內(nèi)催化1 μmol鄰聯(lián)大茴香胺反應所需的酶量。

圖7 純化的katG蛋白過氧化氫酶和過氧化物酶活性比較Fig.7 Comparison of catalase and peroxidase activities of the purified protein katGs

2.2 分子對接

2.2.1異煙肼與katG蛋白活性空腔對接 圖8、9可以看出氧化反應的活性區(qū)域是蛋白質(zhì)內(nèi)部一個以卟啉為平面的狹長疏水區(qū)域，內(nèi)部向外有一個狹小的通道口，約為10?！?0埃大小，僅允許體積較小的分子進入。圖中可以看出，異煙肼進入活性區(qū)域后，親水酰胺基團與ASP137殘基形成氫鍵，阻礙其它小分子進入。異煙肼的六元環(huán)為疏水基團，與卟啉環(huán)平行，兩者之間有疏水作用。分子對接發(fā)現(xiàn)，異煙肼均能進入野生型及其他突變體蛋白質(zhì)的活性空腔，結合的位置相似。

2.2.2異煙肼與野生型katG蛋白對接 對接結果分析得，異煙肼與野生型katG蛋白結合的能量為-6.60 kcal/mol，可見反應是自發(fā)進行的。圖8可以看到，異煙肼與katG蛋白結合的位置位于氧化反應的活性中心，即卟啉環(huán)上方，酰胺氧分別與HIS108和TRP107氨基酸殘基分別形成2.3、2.2埃的氫鍵，結合在卟啉環(huán)上方。酰胺的氧位于Fe原子斜上方，距離為2.8埃。

圖8 katG野生型與異煙肼結合示意圖Fig.8 Schematic diagram of the binding of katG wild type with isoniazid

簇分析發(fā)現(xiàn)，對接能量最低的10個構象都同屬唯一的簇，能量一致?？梢钥闯?，卟啉環(huán)上方的活性空腔既疏水又比較狹小，異煙肼含有親水的酰胺基團，無法進入口袋深部，只能結合在開口處，在其進入氧化活性空腔內(nèi)后，占據(jù)了關鍵位置，阻礙其它分子的進入。

圖9 蛋白質(zhì)氧化活性空腔示意圖Fig.9 Schematic diagram of the reactive cavity of protein oxidation

2.2.3異煙肼與Thr271Pro突變體katG蛋白對接 Thr271Pro突變體katG蛋白與異煙肼分子對接的結合自由能為-6.46 kcal/mol，較野生型升高，提示Thr271Pro突變體KatG蛋白與異煙肼結合的親和性降低。從圖10可以看出，酰胺的氧與Fe原子距離拉開到3.1埃，酰胺上的氫與ASP137上的氧形成了1.9埃氫鍵，而野生型蛋白與異煙肼沒有形成類似的氫鍵。此外，通過圖11發(fā)現(xiàn)ASP137殘基的羧基發(fā)生了一定角度的旋轉(zhuǎn)。

圖10 Thr271Pro突變體katG蛋白與異煙肼作用示意圖Fig.10 Schematic diagram of the interaction of katG(Thr271Pro) mutant with isoniazid

(紅色為katG野生型蛋白，綠色是katG Thr271Pro點突變蛋白)圖11 Thr271點突變蛋白與野生型蛋白結構疊加對比圖Fig.11 Comparison of structural superposition of Thr271Pro mutant protein and Wild-Type katG protein

3 討 論

1992年，Zhang等[6]研究證實katG基因缺陷的耐INH菌株獲得野生型katG基因后，恢復對INH的敏感性，因此認為katG基因在結核分枝桿菌INH耐藥機制中起著關鍵作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，不僅僅是katG基因的完全缺失，katG基因的點突變、堿基的插入與缺失都可能影響其編碼的過氧化氫-過氧化物酶活性，從而無法將INH轉(zhuǎn)化成殺菌活性形式的異煙酸，導致結核菌對INH耐藥[7]。但katG蛋白如何活化異煙肼及katG蛋白突變后導致異煙肼耐藥確切機制并不清楚。若能從基因型突變來判斷表型耐藥，將大大縮短藥敏培養(yǎng)所需時間，及時為臨床用藥提供參考。為此，研究人員在不同程度耐INH菌株中檢測出katG基因不同的突變位點，其中部分突變點被證實導致katG酶活性下降，認為可作為結核菌耐INH的重要標志[8-10]。然而，并非所有的基因位點突變都涉及結核分枝桿菌耐藥，有些為細菌進化自然多態(tài)性變化，有些卻為代償性突變。研究發(fā)現(xiàn)R463L位點的突變是常見的基因多態(tài)性，常常與katG基因其他突變位點一同發(fā)生，并且多見于異煙肼敏感菌株而不是異煙肼耐藥菌株[11]。

本實驗katG(Thr271Pro)突變結核菌株來自江西省異煙肼高水平耐藥株分離培養(yǎng)，MIC為1 mg/L,且katG(Thr271Pro)突變?yōu)閗atG基因唯一突變位點。而katG(AGC315ACC)突變?yōu)槲覈顬槌Ｒ姷幕蛲蛔冃问絒4]。本實驗構建katG野生型、katG(Thr271Pro)突變、katG(AGC315ACC)基因片段，重組至質(zhì)粒pET-22b(+)。選擇該質(zhì)粒原因是其具有氨芐青霉素抗性且能在katG蛋白C端加上6個His的融合標簽，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)pLySs后，可在含氨芐青霉素培養(yǎng)基中挑選轉(zhuǎn)化陽性菌落進行下一步培養(yǎng)。對培養(yǎng)菌蛋白誘導并超聲破碎細菌后，最終可通過鎳親和層析方法純化出帶有6個His融合標簽的katG蛋白。酶活性測得：相比野生型(過氧化氫酶活性361.5 U/mg和過氧化物酶活性77.6 U/mg),katG271突變型過氧化氫酶和過氧化物酶活性分別下降56%和63%(158.8 U/mg和28.7 U/mg),katG315突變型過氧化氫酶和過氧化物酶活性分別下降74%和75%(96.2 U/mg和19.7 U/mg)?？梢钥闯鰇atG271突變型較野生型酶活性大幅度下降，但尚未達到katG315突變型下降程度。由此推斷該異煙肼耐藥菌株katG基因上唯一突變位點katG(Thr271Pro)突變引起了異煙肼耐藥。

通過分子模擬對接研究，能揭示耐藥靶點在結構層次上與藥物的相互作用，闡明藥物耐藥性的機理[12]。為探討katG(Thr271Pro)突變是如何導致異煙肼耐藥，進一步通過分子模擬對接技術發(fā)現(xiàn)katG突變酰胺的氧與Fe原子距離拉開到3.1埃，酰胺上的氫與ASP137上的氧形成了1.9埃氫鍵。野生型的蛋白與異煙肼結合沒有類似氫鍵，ASP137殘基的羧基發(fā)生了一定角度的旋轉(zhuǎn)。而且，Thr271Pro突變體KatG蛋白與異煙肼分子結合的親和性較野生型降低。從而可以推斷，271氨基酸殘基突變后，導致氧化反應活性空腔發(fā)生了一定的變形。

Brossier F等[13]在極高水平異煙肼耐藥菌株(>10 mg/L)中檢測到katG H270R突變，測得過氧化物酶-過氧化氫酶活性幾乎完全喪失，分子對接發(fā)現(xiàn)katG野生型270位置上組氨酸基團位于口袋近端，與亞鐵血紅素鐵離子形成配位鍵。270的突變形成空間阻礙，與亞鐵血紅素失去配位鍵連接，使亞鐵血紅素不能結合上katG蛋白。而本實驗研究對象271突變氧化反應活性空腔發(fā)生了一定的變形，并未完全與血紅素失去聯(lián)系，但酶活性表現(xiàn)非常低。吳海松等[14]在結核病異煙肼治療超過6個月患者體內(nèi)檢測出270、271雙位點突變菌株，密碼子為(ACT-GTT)，此體內(nèi)研究表明該區(qū)域位點突變后，結核分枝桿菌仍在服用異煙肼患者中生長，進一步提示該位點與異煙肼耐藥極為相關。

研究結果提示：katG271位點及鄰近氨基酸殘基均為功能氨基酸，可能是維持katG蛋白活性的重要組分。其突變影響katG酶活性部分缺失及氧化反應活性空腔發(fā)生變形，與異煙肼耐藥關系相關。因此認為katG(Thr271Pro)可作為INH耐藥菌株檢測的參考標志，為臨床INH耐藥基因的篩查、開發(fā)基因芯片等提供重要理論依據(jù)。