DinshKumarK,吳亮姜旭淦陰晴陳盛霞許化溪

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)是一種臨床常見的革蘭陰性桿菌，是引起醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌，常引起ICU、腦外科和呼吸內(nèi)科等病區(qū)暴發(fā)感染[1]。近年來，鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性升高迅速，多重耐藥菌和泛耐藥菌分離率逐年上升[2]。目前我國臨床多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌檢出率已經(jīng)超過銅綠假單胞菌，居革蘭陰性菌中首位，有“革蘭陰性MRSA”之稱[3-4]。

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的一種特殊的死亡現(xiàn)象，其本質(zhì)是細(xì)胞吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并將其包被進(jìn)入囊泡中，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，以降解其所包裹的內(nèi)容物。因此自噬不僅可以清除細(xì)胞內(nèi)受損、老化細(xì)胞器以及錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)，還可以在早期清除侵入細(xì)胞的病原微生物[5]。而近年來，自噬在哺乳動(dòng)物抵抗病原體感染中所發(fā)揮的作用越來越引起人們的研究興趣，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲可以誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象[6-7]。

在人體細(xì)胞中巨噬細(xì)胞是抵御病原體入侵的“第一道屏障”，可以在病原體侵入早期發(fā)揮吞噬清除作用。在各種病原體感染過程中，如果僅誘發(fā)人體巨噬細(xì)胞發(fā)生有限自噬可以幫助機(jī)體清除侵入的病原體并防止感染擴(kuò)散，但當(dāng)巨噬細(xì)胞發(fā)生無限制自噬時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致患者抵抗力下降無法有效清除侵入的病原體，進(jìn)而造成感染范圍擴(kuò)大并導(dǎo)致嚴(yán)重后果[8-9]。鮑曼不動(dòng)桿菌是一種常見臨床致病菌，目前尚無該菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬的研究報(bào)道。本研究探討了鮑曼不動(dòng)桿菌誘導(dǎo)鼠巨噬細(xì)胞自噬能力及機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1菌株和細(xì)胞 鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17978由本課題組保存。鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，由本課題組擴(kuò)增培養(yǎng)后于液氮中大量凍存，取復(fù)蘇后3～7代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 RPIM 1640細(xì)胞培養(yǎng)液購于南京培源生物科技有限公司，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自美國GBICO公司，細(xì)胞培養(yǎng)級胰蛋白酶購自美國HyClone公司，血瓊脂平板購于鄭州安圖生物有限公司，酵母提取物和胰蛋白酶均購于OXOID公司，LC3抗體和Beclin-1抗體購自美國Cell Signaling Technology(CST)公司，羊抗兔IgG抗體購自美國ABclone公司，RIPA裂解液購自南通碧云天公司，細(xì)胞總RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，PVDF膜(0.45 μm)和ECL曝光液購自美國Millipero公司，細(xì)胞培養(yǎng)耗材購自廣州潔特公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純，PCR引物參考相關(guān)文獻(xiàn)由蘇州泓訊生物科技有限公司合成(見表1)[10-12]。

表1 目的基因引物序列及長度
Tab.1 PCR primers and the length of PCR products

基因引物序列(5′-3′)長度/bpatg5F:CTTGCATCAAGTTCAGCTCTTCC R:AAGTGAGCCTCAACCGCATCCT107atg7F:CCTGTGAGCTTGGATCAAAGGCR:GAGCAAGGAGACCAGAACAGTG147atg12F:GAAGGCTGTAGGAGACACTCCTR:GGAAGGGGCAAAGGACTGATTC157ULK1F:CAGTCACCCACCCAGTTCCAAR:CCTCCACCCAGAGCATCTTCC152GABARAPL1F:TATCGGAAAAAGGAAGGAGAAAR:CAACAGTAAGGTCAGAGGGCAC136atg3F:GTCCCTTATTAGAGAAACTGTATR:AGAATATGACTACACAAGACACT147atg4BF:AGGTGCTAACACGGGGCTR:CGGGAGGCCTTACTGCTT134atg16L1F:GTCAGGCCTTATCACACTCTCCR:CAGAACCTCTCTCCCTGTCC146β-actinF:CATTGCTGACAGGATGCAGAAGGR:TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG138

1.2細(xì)胞和細(xì)菌傳代培養(yǎng) Raw 264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含15% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞生長融合至70%時(shí)，以0.25%濃度胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，6孔細(xì)胞板中每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞并繼續(xù)置于37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h用于后續(xù)研究。保存于15%脫脂牛奶中鮑曼不動(dòng)桿菌于血瓊脂平板上四區(qū)劃線生長，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取單個(gè)菌落接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基中，以200 r/min振蕩培養(yǎng)10 h后離心收集細(xì)菌。細(xì)菌以pH 7.2無菌磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline, PBS)洗滌3次，再以PBS緩沖液重懸至OD600=1備用。

1.3細(xì)菌-細(xì)胞共培養(yǎng) 按細(xì)菌數(shù)量:細(xì)胞數(shù)量(multiplicity of infection, MOI)=10∶1比例將鮑曼不動(dòng)桿菌和Raw264.7細(xì)胞共培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)未感染細(xì)菌對照組。于感染30 min時(shí)加入終濃度100 μg/mL慶大霉素殺死未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，以無菌PBS緩沖液洗滌2次徹底除去游離細(xì)菌，繼續(xù)培養(yǎng)至180 min時(shí)中止實(shí)驗(yàn)，收集培養(yǎng)物用于后續(xù)研究。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4Western blotting法檢測 RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白用于Western blotting法檢測。總蛋白樣本通過SDS-PAGE電泳分離，經(jīng)350 mA恒流轉(zhuǎn)印至PVDF膜。LC3抗體和Beclin-1抗體均以1∶1 000倍稀釋后4 ℃孵育過夜。次日以TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。羊抗兔IgG經(jīng)1∶2 000倍稀釋后室溫孵育1 h。在PVDF膜上滴加適量ECL曝光液，顯影并記錄。

1.5qPCR法檢測 嚴(yán)格按照百泰克公司細(xì)胞總RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA用于qPCR檢測。qPCR反應(yīng)條件是95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。記錄目的基因與內(nèi)參的CT值，將目的基因與內(nèi)參基因比較后再與對照組比較，計(jì)算atg mRNA相對表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用Students’ t法分析感染組和正常組細(xì)胞基因和蛋白表達(dá)差異，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Raw264.7細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá) 感染鮑曼不動(dòng)桿菌180 min時(shí)，感染組細(xì)胞atg5、atg7、atg12、ULK1、GABARAPL1、atg3、atg4B和atg16L1基因表達(dá)量與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F(atg5)=0.9918；F(atg7)= 0.9697；F(ULK1)= 0.9871；F(GABARAPL1)=0.8585；F(atg3)=0.9662；F(atg4B)=0.7181；F(atg16L1)=0.7794，P>0.05)，僅atg12基因表達(dá)量高于對照組(F=208.6，P<0.01)(見圖1)。

**：P<0.01圖1 Raw264.7細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)Fig.1 Autophagy related genes expression in Raw 264.7 cells

2.2Raw264.7細(xì)胞LC3和Beclin-1蛋白表達(dá) 感染鮑曼不動(dòng)桿菌180 min時(shí)，感染組細(xì)胞LC3和Beclin1蛋白表達(dá)量均高于對照組(F(LC3)=457.2；F(Beclin-1)=43.27，P<0.01)(見圖2)。

**：P<0.01圖2 Raw264.7細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1表達(dá)Fig.2 Autophagy related proteins LC3 and Beclin-1 expression in Raw 264.7 cells

3 討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌是引起院內(nèi)感染暴發(fā)的重要病原菌，常引起肺部感染，而肺部巨噬細(xì)胞在抵御和清除鮑曼不動(dòng)桿菌感染中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞吞噬鮑曼不動(dòng)桿菌后，可形成吞噬囊泡結(jié)構(gòu)，并與溶酶體融合形成自噬相關(guān)溶酶體，啟動(dòng)細(xì)胞自噬進(jìn)而殺滅侵入的鮑曼不動(dòng)桿菌[13]。通過啟動(dòng)被感染細(xì)胞自噬可以殺滅侵入細(xì)胞的各種病原微生物，防止感染的進(jìn)一步擴(kuò)散。多種病原體已被證實(shí)可以誘發(fā)宿主巨噬細(xì)胞自噬，目前尚未見鮑曼不動(dòng)桿菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬的研究報(bào)道[14-18]。

近些年的研究成果表明患者自噬發(fā)生程度與病原體致病力關(guān)系密切[6, 19]。鮑曼不動(dòng)桿菌所引起患者呼吸道嚴(yán)重感染可誘發(fā)膿毒血癥，其臨床病死率極高[20]。在膿毒血癥中，細(xì)菌感染誘發(fā)巨噬細(xì)胞發(fā)生不可控自噬或，大量巨噬細(xì)胞的自噬可以釋放過量活性氧(reactive oxygen species, ROS)，在殺滅侵入病原體的同時(shí)，也會(huì)造成患者肺正常組織損傷，并進(jìn)一步導(dǎo)致肺功能的衰竭，這是造成患者死亡重要原因之一[21]。我們的研究結(jié)果表明，鮑曼不動(dòng)桿菌的感染可誘導(dǎo)Raw 264.7細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1表達(dá)量增高，提示鮑曼不動(dòng)桿菌能夠誘導(dǎo)Raw 264.7細(xì)胞發(fā)生自噬。通過qPCR法進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動(dòng)桿菌感染可上調(diào)Raw 264.7細(xì)胞atg12基因表達(dá)量。ATG7-ATG4-ATG 8和ATG12- ATG7- ATG5是2條經(jīng)典的自噬信號傳導(dǎo)通路，2條自噬途徑均依賴于Beclin-1蛋白的表達(dá)(ATG6)。綜合我們的研究結(jié)果，我們推測鮑曼不動(dòng)桿菌可以通過ATG12- ATG7- ATG5途徑誘導(dǎo)Raw 264.7細(xì)胞自噬，但其具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。