結(jié)核病(Tuberculosis，TB)主要是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)感染引起的慢性傳染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計，2014年新增約960萬例結(jié)核病例和150萬例死亡病例[1]。世界約有1/3的人口攜帶Mtb，其中90%的攜帶者處于潛伏感染狀態(tài)[2](latent TB infection, LTBI)，這是結(jié)核病復(fù)發(fā)的主要因素。在LTBI狀態(tài)下，Mtb可保持穩(wěn)定但可逆的非復(fù)制狀態(tài)許多年，稱為休眠(dormant，D)。休眠型Mtb(D-Mtb)是導(dǎo)致潛伏性結(jié)核感染(LTBI)的主要原因[3-4]。此時，D-Mtb可在體外培養(yǎng)，并對嚴重缺氧或營養(yǎng)剝奪的不利存活條件具有抗性[5-6]。同時，休眠型桿菌可以調(diào)節(jié)自身代謝以適應(yīng)宿主環(huán)境并干擾宿主免疫系統(tǒng)，進而持續(xù)存在于體內(nèi)的機制仍不十分清楚。

巨噬細胞是阻止體內(nèi)Mtb擴散的主要屏障，巨噬細胞自噬是對抗Mtb的重要免疫機制。 自噬途徑的啟動促進吞噬體的成熟以及與溶酶體的融合，最終導(dǎo)致細胞內(nèi)Mtb被清除[7-8]。 最近的研究已證實，巨噬細胞內(nèi)的Mtb可以通過調(diào)節(jié)其自身的基因表達來抑制吞噬體成熟和/或吞噬體-溶酶體融合，使其免受宿主免疫應(yīng)答的清除，從而有利于其存活并導(dǎo)致適應(yīng)性免疫和LTBI的建立[9]。 因此，潛伏感染的Mtb能夠逃避巨噬細胞的自噬[10]。

已經(jīng)報道了幾種Mtb分泌蛋白有助于Mtb的持續(xù)性感染，其中之一是熱休克蛋白16.3(Heat Shock Protein 16.3, Hsp16.3，也稱為Rv2031c，HspX或Acr)，它們對于維持Mtb的穩(wěn)定性和長期生存力具有重要作用。在LTBI中，Hsp16.3的高表達，表明其參與了Mtb休眠菌的形成[11]。在巨噬細胞或無氧環(huán)境中，Hsp16.3的表達量可增加至Mtb中總細菌蛋白的25%，使細胞增厚以防止宿主細胞誘導(dǎo)的免疫損傷[12-13]。因此，Hsp16.3可能通過一些途徑調(diào)節(jié)巨噬細胞的自噬功能，從而維持宿主細胞中Mtb的存活。本文我們將討論休眠細菌如何通過Hsp16.3調(diào)控自噬，從而逃逸巨噬細胞自噬體的作用，提示Hsp16.3有可能作為LTBI的潛在生物標(biāo)志物和抗結(jié)核藥物的新靶點。

1 休眠的結(jié)核分枝桿菌和自噬

LTBI是產(chǎn)生陽性結(jié)核菌素試驗(PPD)的亞臨床狀態(tài)，但是其胸部X射線檢測無明顯的結(jié)核感染跡象[14]。在這種狀態(tài)下，休眠桿菌可以在宿主體內(nèi)存活但不產(chǎn)生任何癥狀或體征，直至某些條件得到滿足，此時桿菌突然從休眠中復(fù)蘇，開始復(fù)制，最終導(dǎo)致結(jié)核病發(fā)生[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在低氧環(huán)境中，Mtb會改變某些酶(如檸檬酸水解酶)的表達，從而改變其代謝途徑而進入休眠狀態(tài)[15]。作為對Mtb感染的主要屏障，活化的巨噬細胞釋放有毒的活性氧和氮來直接殺死Mtb，而自噬則對胞內(nèi)病原體的清除發(fā)揮了重要作用[16]。Cheallaigh等[10]證實巨噬細胞通過增加自噬體成熟及自噬體-溶酶體融合來啟動細胞自噬以除去感染細菌。Gutierrez等[17]和Amano等[18]發(fā)現(xiàn)自噬與巨噬細胞中Mtb的活性密切相關(guān)。此外，自噬促進樹突狀細胞(DC)的成熟，并刺激適應(yīng)性免疫應(yīng)答以除去細胞內(nèi)的細菌[19]。當(dāng)用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)和針對beclin-1的siRNA(atg6)一起處理DC或巨噬細胞時，2種細胞的抗原呈遞能力均顯著降低，自噬發(fā)生減弱。這增加了細胞內(nèi)分枝桿菌的生存能力，并降低了它們的清除率，使之持續(xù)感染[20]。因此，LTBI與巨噬細胞自噬密切相關(guān)。這種關(guān)系存在的潛在原因包括： 1)休眠菌可阻止吞噬體成熟及吞噬體-溶酶體融合; 2)Mtb改變了巨噬細胞自噬相關(guān)基因的表達以阻礙病原體向溶酶體的輸送并防止溶酶體降解。這使得Mtb能夠存活、復(fù)制并最終從巨噬細胞逃脫[16]。

2 Hsp16.3和LTBI

Hsp16.3是α-晶狀蛋白型熱休克蛋白，由144個氨基酸組成，分子量約為16.3 kDa。α-晶狀蛋白結(jié)構(gòu)域是位于C-末端的90～100個氨基酸殘基[21]，它是Mtb免疫原性最強的潛伏相關(guān)抗原之一。敲除實驗顯示Hsp16.3是巨噬細胞中Mtb復(fù)制的關(guān)鍵因子[22]。當(dāng)Mtb在低氧條件下培養(yǎng)或在巨噬細胞中生長時，Hsp16.3的表達被上調(diào)[23]。acr基因的缺失明顯減弱了Mtb的毒力，并顯著削弱了其在小鼠骨髓衍生的巨噬細胞和THP-1巨噬細胞中的生長[24]，這表明Hsp16.3的表達提高了Mtb在巨噬細胞中的生存能力。體外研究顯示，在LTBI中，Mtb增加了編碼Hsp16.3的DosR(休眠存活調(diào)節(jié)基因)，特別是Rv2031c的表達[25]。根據(jù)其在先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中的重要功能，Hsps被認為是結(jié)核病理想的生物標(biāo)志物[26]，特別是Hsp16.3與Mtb休眠狀態(tài)有關(guān)。

高水平的Th1細胞因子和ROS可促進Mtb感染的巨噬細胞的自噬[27]。在Mtb感染的早期階段，Hsp16.3分泌誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生IFN-γ以清除Mtb[21]。然而，在豚鼠實驗中，基于Rv2031c的疫苗接種顯示通過增強的IL-12，IL-10和TGF-β的產(chǎn)生來提供對抗結(jié)核的保護作用[28]。在LTBI期間，Rv2031c可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IL-10[29]，IL-10和TGF-β通過抑制T細胞產(chǎn)生IFN-γ，阻斷或抑制巨噬細胞活化和凋亡，從而使Mtb在巨噬細胞中存活。已有實驗證實宿主中IL-10的增加與細菌抗性的降低相關(guān)[30]。肺泡巨噬細胞、單核細胞衍生的巨噬細胞或THP-1細胞在感染了野生型或Mtb減毒株后，用抗IL-10抗體進行處理，顯著促進吞噬體成熟[31]。IL-10主要是通過激活轉(zhuǎn)錄因子3(STAT3)途徑抑制自噬體的成熟，這與報道的STAT3參與IL-10介導(dǎo)下調(diào)宿主的炎性反應(yīng)相一致[32]。圖1顯示了我們推測在LTBI中Hsp16.3干擾巨噬細胞自噬的作用模式。

圖1 Hsp16.3可能參與Mtb感染中抑制巨噬細胞自噬的信號通路Fig.1 The signaling pathway of Hsp16.3 inhibiting autophagy in macrophages in Mtb infection

一些研究揭示了α-晶體蛋白在調(diào)節(jié)細胞活力和保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用，該蛋白可直接作用于線粒體以減少氧化應(yīng)激[33]。據(jù)報道，細胞外α-晶體蛋白通過激活MAPK / PI3K / Akt信號通路，并阻斷線粒體釋放ROS來保護星形膠質(zhì)細胞[34]。因此，Hsp16.3可以通過活化抑制自噬的信號傳導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生。然而，細胞因子與Hsp16.3之間是否存在明確的聯(lián)系，以及Hsp16.3影響細胞因子產(chǎn)生的機制還需要進一步的研究。

在LTBI中，Hsp16.3通過IL-10的產(chǎn)生，一方面抑制T細胞產(chǎn)生IFN-γ，抑制巨噬細胞活化，同時IL-10通過激活STAT3途徑抑制自噬體的成熟和ROS的產(chǎn)生抑制自噬的發(fā)生。

近期的研究中報道，通過評估小鼠巨噬細胞RAW264.7中LC3II免疫熒光斑點的表達，觀察了Mtb中Hsp16.3基因缺失(Hsp16.3ΔMTB)對巨噬細胞自噬的影響[35]。結(jié)果顯示Hsp16.3缺失促進了巨噬細胞中自噬的形成，支持了Hsp16.3抑制LTBI中的巨噬細胞自噬的假說。為了證實Hsp16.3ΔMTB誘導(dǎo)自噬的發(fā)生而不是抑制自噬降解，將巨噬細胞在巴弗洛霉素A1(BAF)處理后用Hsp16.3ΔMTB感染。此時，LC3 II的表達高于未用BAF處理的Hsp16.3ΔMTB感染的細胞。此外，通過形態(tài)觀察和計算分析了RAW 264.7細胞吞噬的Hsp16.3ΔMTB的CFU。結(jié)果顯示Hsp16.3ΔMTB感染用雷帕霉素處理的巨噬細胞，只存活少量的Mtb，而用3-MA抑制劑和BAF處理的巨噬細胞可觀察到更多的Mtb。這些結(jié)果表明LC3II斑點的積累可以被解釋為自噬增加而不是自噬成熟的抑制[35]。

3 Hsp16.3是LTBI的潛在生物標(biāo)志物

由于結(jié)核病復(fù)發(fā)率高，因此迫切需要及時、準(zhǔn)確地檢測和診斷LTBI。盡管結(jié)核菌素皮膚試驗是傳統(tǒng)的檢測方法，但其診斷LTBI的能力有限，并且在接種BCG的個體中受到高假陽性率的困擾[36]。基于T細胞的IFN-γ釋放試驗(IFN-g release assay，IGRA)更廣泛地用于LTBI的檢測，但由于其不能區(qū)分LTBI與活動性TB，所以仍然需要高靈敏度和特異性的免疫標(biāo)記物。我們嘗試制備了Mtb分泌蛋白(ESAT6，CFP10，Ag85B，Hsp16.3)和融合蛋白Ag85B-Hsp16.3，通過ELISA檢測針對這4種分泌蛋白的IgG血清抗體，在活動性結(jié)核患者和LTBI患者中評估確認感染的能力[37]。結(jié)果顯示：Ag85B-Hsp16.3 / ESAT6和Hsp16.3 / ESAT6是活性TB和LTBI個體血清學(xué)診斷的最佳關(guān)聯(lián)抗原，ELISA檢測結(jié)果顯示41.67%(25/60)獻血員對Ag85B-Hsp16.3 / ESAT6有反應(yīng)。這種陽性反應(yīng)與臨床診斷的一致性幾乎達到84%。提示基于Hsp16.3的多種Mtb分泌蛋白Ag85B和ESAT6的聯(lián)合檢測可能是區(qū)分活動性TB和LTBI患者的有效篩選抗原。

Hsp16.3不僅與宿主內(nèi)Mtb的穩(wěn)定性相關(guān)，而且含有多個人T細胞和B細胞表位[38-39]；如其～p91-p110，～p21-p29和～p120-p128多肽表位都能夠活化CD4+T細胞和CD8+T細胞，通過分泌IFN-γ清除Mtb的感染[40]。Belay等人[29]在LTBI患者中發(fā)現(xiàn)針對Rv2031c誘導(dǎo)高水平的TNF-α和IL-10。這提示針對Rv2031c的TNF-α和IL-10拮抗劑可能是LTBI患者保護性免疫的潛在生物標(biāo)志物。因此，Hsp16.3可作為活動性結(jié)核病和LTBI患者診斷的輔助指標(biāo)[37]，對高?；颊叩慕Y(jié)核病篩查和早期診斷具有重要意義。

4 展 望

除了作為一個潛在的診斷標(biāo)志物，HspX還能在應(yīng)激條件下(包括休眠狀態(tài))通過調(diào)節(jié)參與宿主代謝的關(guān)鍵酶來適應(yīng)宿主環(huán)境，從而維持Mtb蛋白的穩(wěn)定性[41]。Hsp16.3的分子伴侶活性依賴于N-末端的結(jié)構(gòu)和C-末端的α-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域[42]。在晶狀體結(jié)構(gòu)域的疏水表面和在N-端區(qū)域的疏水殘基具有底物分子的主要結(jié)合位點，如熒光素酶(Luc)、檸檬酸合成酶和蘋果酸脫氫酶(MDH)等[43-44]。這些酶可能會影響休眠菌和宿主之間的相互作用，或是改變Hsp16.3的結(jié)構(gòu)抑制細菌生長[22]。進一步研究，以探索Mtb通過Hsp16.3抑制宿主細胞自噬發(fā)生的特定分子信號通路和相關(guān)的調(diào)控分子，可能會發(fā)現(xiàn)新的結(jié)核病候選藥物和潛在的LTBI生物標(biāo)志物，有助于控制LTBI的發(fā)生。