吳亦斐，趙 剛，陳淑丹2，張學潮，李清春，陸 敏，程慶林，嚴 杰3，謝 立

結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染引起的結核病是全球流行的常見傳染病，嚴重危害人類健康[1]，耐藥尤其耐多藥或廣泛耐藥結核分枝桿菌感染所致的結核病一直是該病防控工作中的重點和難點[2]。我國是結核病高負擔國家之一，結核病患者約占全球病例總數(shù)的25%[3]，近年來我國進行了多次全國性結核分枝桿菌耐藥狀況檢測，浙江地區(qū)也不例外，結果均顯示該菌耐藥性依然嚴重且耐藥菌株流行[4-6]。盡管結核分枝桿菌可感染各種組織和器官并引起疾病，但以肺結核最為常見[7-8]。相對于大中城市而言，縣鎮(zhèn)人群衛(wèi)生條件和醫(yī)療水平較差，了解這些地區(qū)結核病流行現(xiàn)狀、病原體種類及其耐藥情況，對于結核病防控具有重要意義。本研究對杭州市周邊7個縣鎮(zhèn)3 552例臨床診斷為肺結核患者標本進行了分枝桿菌分離鑒定和結核分枝桿菌藥物敏感試驗，分析了這些地區(qū)結核分枝桿菌流行現(xiàn)狀、耐藥性與優(yōu)勢耐藥組合模式以及性別、年齡、職業(yè)和戶籍對肺結核患病率的影響，為制定更為有效的結核病防控策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1臨床標本來源 2013年1月至2016年12月杭州市周邊7個縣鎮(zhèn)3 552例臨床診斷為肺結核患者抗酸染色陽性痰涂片分枝桿菌培養(yǎng)物由各縣鎮(zhèn)結核病定點醫(yī)院提供。病例分類：①初治：未接受抗結核藥物治療或抗結核藥物治療1個月以內(nèi)；②復治：接受抗結核藥物治療一個月以上[9-10]。上述3 552例患者中，2 840例為初治患者、712例為復治患者，男性2 526例、女性1 026例，年齡范圍10～94歲。

1.2分枝桿菌分離培養(yǎng) 上述分枝桿菌培養(yǎng)物標本接種于酸性改良羅氏培養(yǎng)基，按結核病實驗室檢驗規(guī)程分離培養(yǎng)分枝桿菌[11]。酸性改良羅氏培養(yǎng)基購自杭州市創(chuàng)新生物技術有限公司。

1.3結核分枝桿菌鑒定 按結核病實驗室檢驗規(guī)程，采用對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)選擇與鑒別培養(yǎng)法對上述分枝桿菌陽性培養(yǎng)物進行分枝桿菌菌種鑒定[11]。TCH培養(yǎng)基上生長但PNB培養(yǎng)基上不生長的菌株判為人型結核分枝桿菌(Mycobacteria tuberculosis)，PNB和TCH培養(yǎng)基上均不生長的菌株判為牛型結核分枝桿菌(Mycobacteria bovis)，均屬于結核分支桿菌復合群(mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)，簡稱為結核分枝桿菌。兩種培養(yǎng)基上均生長的菌株判為非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)。PNB和TCH培養(yǎng)基購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.4藥物敏感試驗 按結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程，采用間接比例法檢測結核分枝桿菌菌株對異煙肼(INH)、鏈霉素(SM)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、卡那霉素(KM)和氧氟沙星(OFX)的敏感性[11]。滅菌接種環(huán)取一環(huán)各結核分枝桿菌菌株對數(shù)生長期培養(yǎng)物，無菌磨砂管碾磨后用滅菌磷酸緩沖鹽水(PBS)配制成1.0麥氏濃度菌液，然后用PBS稀釋成10-2和10-4CFU/mL菌液。取0.01 mL不同稀釋濃度菌液均勻密集劃線接種于含藥或無藥培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)4～8周，同一稀釋濃度含藥培養(yǎng)基上的菌落數(shù)生長菌落數(shù)與無藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)比較>1%判為耐藥。INH耐藥臨界濃度為0.2 μg/mL、SM耐藥臨界濃度為4.0 μg/mL、RFP耐藥臨界濃度為40 μg/mL、EMB耐藥臨界濃度為2.0 μg/mL、KM耐藥臨界濃度為30 μg/mL、OFX耐藥臨界濃度為4.0 μg/mL。INH、SM、RFP和EMB購自杭州市創(chuàng)新生物技術有限公司，OFX和KM購自珠海貝索生物技術有限公司。實驗中采用結核分枝桿菌參考標準株H37RV為對照。

1.5結核分枝桿菌耐藥類型分析 INH、SM、RFP、EMB為臨床一線抗結核藥物，KM和OFX為二線抗結核藥物[11-13]。結核分枝桿菌耐藥類型如下：①總耐藥：對1種或1種以上抗結核藥物耐藥；②單耐藥：僅對1種抗結核藥物耐藥；③一線藥物耐藥：對1種或1種以上一線抗結核藥物耐藥；④耐多藥：對INH和RFP耐藥，也包括同時對其他一線抗結核藥物耐藥； ⑤多耐藥：對1種或1種以上一線抗結核藥物耐藥，但不包括同時對INH和RFP耐藥；⑥廣泛耐藥：同時對INH和RFP耐藥外，還對1種氟喹諾酮類抗生素和1種其他二線抗結核藥物耐藥[12-13]。

1.6肺結核患病率影響因素分析 確診為肺結核患者(有肺結核臨床表現(xiàn)并檢出結核分枝桿菌)性別、年齡、職業(yè)和不同人群來源進行分析，以了解上述因素對肺結核患病率的影響。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件中χ2檢驗對不同藥物耐藥率以及各種肺結核患病影響因素進行統(tǒng)計學分析，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1分枝桿菌菌種鑒定結果 3 552例分枝桿菌陽性培養(yǎng)物中，88.7%(3 152/3 552)鑒定為結核分枝桿菌，11.3%(400/3 552)鑒定為非結核分枝桿菌(表1)。3 152株結核分枝桿菌中，82.8%(2 609/3 152)來自初治患者，17.2%(543/3 152)來自復治患者。400株非結核分枝桿菌中，57.8%(231/400)菌株來自初治患者，42.2%(169/400)菌株來自復治患者，復治患者感染非結核分枝桿菌比例(23.7%，169/712)顯著高于初治患者(8.1%，231/2 840)(χ2=138.67,P<0.05)。

2.2結核分枝桿菌耐藥率和耐藥組合模式 3 152株結核分枝桿菌中，74.9%(2 362/3 152)菌株對各受試藥物敏感，25.1%(790/3 152)菌株至少對一種抗結核藥物耐藥，6種抗結核藥物中SM(χ2=50.40，P<0.05)和INH(χ2=47.81，P<0.05)耐藥率較高，然后依次為RFP、OFX、EMB和KM，來自初治患者結核分枝桿菌對不同抗結核藥物耐藥率排序與之相同，來自復治患者結核分枝桿菌對INH耐藥率最高、其次為SM，其他抗結核藥物耐藥率排序相同，但來自復治患者結核分枝桿菌對各抗結核藥物的單藥耐藥率顯著高于初治患者(表1)。790株耐藥結核分枝桿菌中，有35種耐藥譜(耐藥種類和組合模式)；對單個抗結核藥物的耐藥率以SM最高、其次是INH，但來自復治患者結核分枝桿菌對單個藥物的耐藥率以INH最高、其次是SM；2、3和4種抗結核藥物優(yōu)勢耐藥組合模式分別是INH+SM(9.2%)(χ2=19.20，P<0.05)、INH+RFP+SM(5.7%)(χ2=24.85，P<0.05)和IHN+RFP+SM+EMB(4.3%)(χ2=20.11，P<0.05)(表2)。

表1 3 152株結核分枝菌株對不同抗結核藥物的耐藥率
Tab.1 Resistance ratios of 3 152M.tuberculosisisolates against different anti-tuberculosis drugs

藥物初治病例菌株(n=2 609)復治病例菌株(n=543)總菌株(n=3 152)χ2P耐藥株數(shù)耐藥率(%)耐藥株數(shù)耐藥率(%)耐藥株數(shù)耐藥率(%)SM29711.410719.740412.827.85<0.05INH2549.714526.739912.7117.04<0.05RFP1375.39717.92347.4104.03<0.05OFX983.8427.71404.416.76<0.05EMB562.2407.4963.141.48<0.05KM170.791.7260.85.560.036

表2 790株耐藥結核分枝桿菌菌株的耐藥譜
Tab.2 Profile of 790 drug resistantM.tuberculosisisolates

耐藥譜初治耐藥菌株(n=582)復治耐藥菌株(n=208)總耐藥菌株(n=790)株數(shù)構成比(%)株數(shù)構成比(%)株數(shù)構成比(%)SM16027.52512.018523.4INH11018.93416.414418.2OFX7512.9115.38610.9RFP559.5178.2729.1EMB111.900111.4KM30.510.540.5合計41471.48842.350263.5INH+SM528.92110.1739.2INH+RFP122.1188.7303.8INH+OFX40.752.491.1INH+EMB40.720.960.8INH+KM10.20010.1SM+OFX50.920.970.9SM+EMB30.510.540.5SM+KM20.30020.3RFP+SM91.620.9111.4RFP+EMB10.210.520.3RFP+OFX10.210.520.3合計9416.25325.514718.6INH+RFP+SM264.5199.1455.7INH+SM+EMB71.220.991.1INH+SM+OFX20.341.960.8INH+SM+KM30.510.540.5INH+RFP+OFX30.552.481.0INH+RFP+EMB10.231.440.5INH+RFP+KM10.20010.1SM+EMB+OFX10.210.520.3SM+EMB+KM10.210.520.3RFP+SM+KM10.20010.1合計467.93617.38210.4IHN+RFP+SM+EMB172.9178.2344.3IHN+RFP+SM+OFX10.210.520.3IHN+RFP+SM+KM0010.510.1IHN+RFP+EMB+OFX30.531.460.8IHN+SM+EMB+KM10.20010.1IHN+RFP+SM+EMB+OFX20.341.960.8IHN+RFP+SM+EMB+KM30.50030.4IHN+RFP+SM+EMB+OFX+KM10.252.460.8合計284.83114.9597.5

2.3結核分枝桿菌耐藥類型 3 152株結核分枝桿菌中，25.1%(790/3 152)至少對一種藥物耐藥(總耐藥)，15.9%(502/3 152)、22.2%(700/3 152)、4.6%(146/3 152)、3.9%(122/3 152)和0.2%(6/3 152)分別為單耐藥、一線抗結核藥物耐藥、耐多藥、多耐藥和廣泛耐藥(表3)。初治和復治患者結核分枝桿菌單耐藥率無顯著性差異(χ2=0.04，P>0.05)，但復治患者結核分枝桿菌總耐藥、一線藥物耐藥、耐多藥、多耐藥和廣泛耐藥率均顯著高于初治患者(表3)。

表3 結核分枝桿菌耐藥類型及其分布
Tab.3 Drug resistance types and their distribution inM.tuberculosisisolates

菌種初治病例菌株(n=2 609)復治病例菌株(n=543)總菌株(n=3 152)χ2P耐藥株數(shù)耐藥率(%)耐藥株數(shù)耐藥率(%)耐藥株數(shù)耐藥率(%)總耐藥58222.320838.379025.161.14<0.05單耐藥41415.98816.250215.90.04>0.05一線藥物耐藥50419.319636.170022.273.24<0.05耐多藥702.77614.01464.6130.23<0.05多耐藥863.3366.61223.913.42<0.05廣泛耐藥10.0450.960.218.42<0.05

2.4肺結核患病率影響因素 3 152例檢出結核分枝桿菌的肺結核患者中，男性(71.6%，2 256/3 152)顯著多于女性(28.4%，896/3 152)(χ2=1173.60，P<0.05)；>60年齡組肺結核患病率(39.3%，1 240/3 152)顯著高于41～60年齡組(27.6%，870/3 152)(χ2=94.97，P<0.05)、21～40年齡組(27.8%，875/3152)(χ2=97.52，P<0.05)和≤20(5.3%，167/3 152)年齡組(χ2=1053.39，P<0.05)，41～60和21～40年齡組肺結核患病率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.02，P>0.05)，但均高于≤20年齡組(χ2=570.41，P<0.05)；農(nóng)民肺結核患病率顯著高于其他職業(yè)(χ2=1500.34，P<0.05)；本地戶籍肺結核患病率顯著高于外地戶籍(χ2=1435.29，P<0.05)(表4)。

表4 肺結核患病率影響因素分析
Tab.4 Drug resistance types and their distribution inM.tuberculosisisolates

影響因素初治病例(n=2609)復治病例(n=543)總病例(n=3152)例數(shù)構成比(%)例數(shù)構成比(%)例數(shù)構成比(%)性別 男性1 81069.444682.12 25671.6 女性79930.69717.989628.4年齡 0～201576.2101.81675.3 21～4077729.89818.187527.8 41～6068826.418233.587027.6 >6098737.825346.61 24039.3職業(yè) 農(nóng)民1 55759.737068.11 92761.1 企事商業(yè)職工38214.65610.343813.9 民工29511.3519.434611.0 教師/學生1184.5001183.7 離退人員1756.7478.72227.1 其他職業(yè)823.2193.51013.2戶籍 本地1 89872.743079.22 32873.9 外地71127.311320.882426.1

3 討 論

結核病曾肆虐全球絕大多數(shù)國家和地區(qū)，廣泛接種結核疫苗和抗結核藥物問世后，結核病疫情一度受到控制，但近年來結核病又開始廣泛流行，成為最常見的再發(fā)傳染病(re-emerging disease)[14]。2017年WHO報道，全球每年新增結核病患者約960萬，其中耐多藥結核病患者48萬[15]，我國每年新增耐多藥結核病患者也高達12萬左右[12]。結核病再次廣泛流行的因素復雜多樣，其中結核分枝桿菌不斷增強的耐藥性是首要因素[16-18]。一般而言，大中城市人群衛(wèi)生知識和條件對比縣鎮(zhèn)地區(qū)人群較好且醫(yī)療水平較高。因此，縣鎮(zhèn)地區(qū)人群結核病發(fā)病率以及結核分枝桿菌耐藥性監(jiān)測是各國疾病預防控制中心的重要任務，進而了解結核病和結核分枝桿菌耐藥菌株流行總體現(xiàn)狀，同時為更有效地防控和診治結核病提供依據(jù)[19]。

非結核分枝桿菌指除結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的其他分枝桿菌總稱，感染后可引起NTM肺病。本研究對2013-2016年杭州周邊7個縣鎮(zhèn)3 552例臨床診斷為肺結核患者臨床標本的病原體檢測結果顯示，3 152例為結核分枝桿菌、400例為NTM。值得關注的是，復治患者NTM感染率為23.7%，初治患者僅為8.1%，兩者感染率之間存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。有文獻報道，除結核分枝桿菌外，近年來NTM感染率也不斷上升，此類分枝桿菌對各種抗結核藥物常呈高耐藥性，呼吸道也是其常見感染和致病部位[20-23]。結核病通常是慢性消耗性疾病，患者通常抗感染免疫力低下或受損，抗結核藥物治療中易感染高耐藥性NTM[24]。上述資料提示，肺結核患者抗結核藥物治療過程中，特別注意高耐藥性非結核分枝桿菌再感染。

INH、SM、RFP、EMB為臨床常用一線抗結核藥物[11-13]。我們的藥物敏感試驗結果顯示，初治或復治患者中分離的結核分枝桿菌對SM和INH耐藥率(12.8%和12.7%)顯著高于RFP和EMB(7.4%和3.1%)(P<0.05)，與近年浙江省和杭州市區(qū)耐藥調(diào)查結果一致[6, 25]。值得關注的是，來自復治病例的結核分枝桿菌對各一線抗結核藥物耐藥率均顯著高于初治患者(P<0.05)。上述資料提示，可能由于一線抗結核藥物中INH和SM使用頻率較高，結核分枝桿菌更易產(chǎn)生耐藥性，但不規(guī)范使用抗結核藥物往往是促進結核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥性的重要因素，值得基層臨床醫(yī)師特別注意。

為了提高治療效果和減少耐藥性產(chǎn)生，結核病治療中通常聯(lián)合用藥[19]。本研究結果分析顯示，790株耐藥結核分枝桿菌中有高達35種耐藥譜(耐藥種類和組合模式)，2、3和4種抗結核藥物優(yōu)勢耐藥組合模式分別是INH+SM、INH+RFP+SM和IHN+RFP+SM+EMB(P<0.05)。上述資料提示，結核分枝桿菌菌株對不同抗結核藥物耐藥性差異較大，不同結核病患者治療前后反復進行藥物敏感試驗極為必要，以選擇更佳藥物組合獲得更好療效，結核分枝桿菌菌株已對SM和INH有較高耐藥率，治療前更應根據(jù)藥物敏感試驗結果選擇用藥。

根據(jù)臨床上常用抗結核藥物種類及其聯(lián)合用藥方案，可將結核分枝桿菌耐藥類型分為總耐藥、單耐藥、一線藥物耐藥、耐多藥、多耐藥和廣泛耐藥[12-13]。我們的藥物敏感試驗結果顯示：結核分枝桿菌總耐藥、耐多藥和廣泛耐藥率分別為25.1%、4.6%和0.2%，初治或復治患者結核分枝桿菌總耐藥率分別為22.3%和38.3%。根據(jù)最近2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調(diào)查報告，結核分枝桿菌總耐藥率為42.1%、耐多藥率為6.8%、廣泛耐藥2.1%，但初治患者結核分枝桿菌總耐藥率為42.7%、復治患者為38.5%[5]。安徽省2014年初治和復治患者結核分枝桿菌總耐藥率分別為15.9%和52.9%，2008和2000年浙江省初治和復治患者結核分枝桿菌總耐藥率分別為26.6%和50.0%、18.6%和68.5%[26-27]。上述資料表明，2013-2016年杭州郊縣(區(qū))初治和復治患者結核分枝桿菌總耐藥、耐多藥和廣泛耐藥率均低于全國平均水平，復治患者結核分枝桿菌總耐藥率低于本省2000年和2008年以及安徽省2014年水平，初治患者結核分枝桿菌總耐藥率雖低于本省2008年平均水平，但高于本省2000年和安徽省2014年水平，提示本地區(qū)耐藥結核分枝桿菌流行和傳播情況仍然較為嚴重。

除病原體外，結核病罹患和流行的影響因素眾多，營養(yǎng)和衛(wèi)生狀況是結核病危險因素[1, 17-18]。我們的分析結果顯示，3 152例肺結核患者中，男性患者多于女性、年齡越大患病率越高、農(nóng)民肺結核患病率高于其他職業(yè)(P<0.05)。令人意外的是，上述患者中本地戶籍者肺結核患病率顯著高于外地戶籍(P<0.05)。外地戶籍者大多為來杭基層打工的青壯年，以往認為該人群生活和衛(wèi)生條件相對較差，除年齡偏低外，其肺結核患病率較低可能與近年杭州周邊縣鎮(zhèn)經(jīng)濟和衛(wèi)生環(huán)境有明顯改善有關。中國已進入老齡化社會，60歲以上人口比例持續(xù)增大，老年人群肺結核患病率較高可能與機體免疫力下降以及打牌等室內(nèi)小群體活動多、戶外活動少等習慣有關。因此，縣鎮(zhèn)地區(qū)本地戶籍老年男性農(nóng)民可能成為肺結核易感人群，值得繼續(xù)調(diào)查和關注。