任 紅，郭敏杰，霍鶴宇，姚光曉，王世珍,2

1)廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建廈門361005； 2)廈門市合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 310065

手性胺是香料、醫(yī)藥和有機(jī)合成工業(yè)的重要中間體[1]．手性胺不同對(duì)映異構(gòu)體的立體結(jié)構(gòu)的差異使不同的手性對(duì)映體的活性不同，作用于生命體時(shí)表現(xiàn)出的生理活性和毒害作用也不同[2]．因此，手性逐漸成為檢驗(yàn)藥物安全性和藥效的重要因素，單一手性對(duì)映體藥物的比例逐年上升[3]．手性胺的制備方法主要有化學(xué)法和生物催化法，與傳統(tǒng)的化學(xué)催化劑相比，生物酶催化劑對(duì)手性分子的兩種對(duì)映體具有天然的識(shí)別能力，使生物催化技術(shù)在手性藥物選擇性合成中具有顯著的優(yōu)勢(shì)[4-5]．此外，生物催化還具有高效、高選擇性、條件溫和以及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)．

胺脫氫酶(amine dehydrogenase, AmDH)能夠在輔酶的作用下催化前手性酮和游離氨不對(duì)稱合成手性胺的，而催化反應(yīng)過(guò)程需要輔酶作為電子傳遞體參與反應(yīng)，可以使該反應(yīng)與輔酶再生系統(tǒng)耦聯(lián)，如葡萄糖-葡萄糖脫氫酶或甲酸鹽-甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase, FDH)系統(tǒng)．CHEN等[6]構(gòu)建了雙酶耦聯(lián)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，利用亮氨酸脫氫酶(EsLeuDH)為模板定向設(shè)計(jì)獲得突變體K77S/N270L與醇脫氫酶耦聯(lián)合成手性胺．YE等[7]利用PheDH作為骨架進(jìn)行酶改造獲得的AmDH與葡萄糖脫氫酶耦聯(lián)制備手性胺，其產(chǎn)物對(duì)映體選擇性可達(dá)99%(對(duì)映體過(guò)量值)． 酶有一般化學(xué)催化劑難以匹敵的優(yōu)點(diǎn)，但仍有一些缺點(diǎn)令它難以在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用，其中影響最大的就是酶的穩(wěn)定性較差．將酶蛋白進(jìn)行固定化不僅能夠提高酶的穩(wěn)定性，且能夠回收重復(fù)使用酶蛋白．仿生合成也稱模板合成[8]，是模擬生物礦化中生物礦物的形成過(guò)程，選擇有機(jī)物作為模板，在模板的誘導(dǎo)或調(diào)控下生成無(wú)機(jī)物的一種合成方法． 2003年，SUMEREL等[9]首次將硅蛋白(silicatein)用于氧化鈦的合成中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硅蛋白能作為催化劑誘導(dǎo)鈦前驅(qū)體二(2-羥基丙酸(二氫氧化二銨合鈦))(titanium(IV)bis-(ammoniumlactato)-dihydroxide, Ti-BALDH)的水解和縮聚，并生成無(wú)定形的氧化鈦，該研究開啟了仿生鈦化的新篇章．近年來(lái)，已有諸多有關(guān)基于仿生鈦化的有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化層層自組裝的研究成果應(yīng)用于酶的固定化方面[10-12]．支鏈聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)攜有大量帶正電的氨基，能夠通過(guò)靜電引力和氫鍵催化鈦前驅(qū)體和硅前驅(qū)體縮聚，因此，可以用于仿生鈦化[8,13-14]．

本文分別研究了游離AmDH-FDH耦聯(lián)體系和仿生鈦化的AmDH-FDH制備手性胺，旨在探究一種輔酶循環(huán)效率高的多酶耦聯(lián)體系．

1 材料與方法

1.1 菌株培養(yǎng)及純酶制備

所用菌株為實(shí)驗(yàn)室保存的表達(dá)AmDH(源自Bacillusbadius， Genebank D50261 436-1578)以及表達(dá)FDH(源自Candidaboidinii， Genebank number AJ011046.2)的重組大腸桿菌． 將菌種(接種體積分?jǐn)?shù)量1%)接種到10 mL含50 μg/L卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min下過(guò)夜培養(yǎng)．取體積分?jǐn)?shù)為1%的培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)接到100 mL含50 μg/L卡那霉素液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)2～3 h至光密度D(600)為0.6～0.8．加入異丙基 β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)至終濃度為0.1 mmol/L，25 ℃培養(yǎng)12 h后離心收集重組菌菌體．將菌體用PBS緩沖液沖洗兩次后重懸制備菌懸液，用細(xì)胞超聲破碎儀破壁后離心，上清液即為粗酶液．由于pET-28a(+)質(zhì)粒帶有His6-tag標(biāo)記，使表達(dá)得到的AmDH與FDH帶有His6-tag，因而選擇GE公司的HisTrap HP柱進(jìn)行純化．純化方法如下：首先用結(jié)合緩沖液進(jìn)行預(yù)平衡10個(gè)Histrap HP柱體積，平衡后將蛋白樣品注入Histrap柱，用結(jié)合緩沖液平衡20個(gè)柱體積，接著用洗脫緩沖液20 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(含0.5 mol/L氯化鈉, 500 mmol/L 咪唑, pH=7.4)進(jìn)行梯度洗脫，自動(dòng)收集流出液，檢測(cè)其酶活性，收集具有酶活性的純化樣品，以Millipore超濾管(截留分子質(zhì)量為10 kDa，1 Da=1 u)進(jìn)行濃縮和脫鹽后保存于4 ℃．

1.2 胺脫氫酶與甲酸脫氫酶反應(yīng)體系及活性檢測(cè)

AmDH和FDH分別是還原型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)和氧化型輔酶NAD+依賴型氧化還原酶，NADH在340 nm波長(zhǎng)附近有最大光密度值，因此，可通過(guò)檢測(cè)輔酶NADH的消耗或生成速率來(lái)計(jì)算AmDH和FDH的活性．

酶活力單位的定義：規(guī)定條件下，單位體積每分鐘催化生成或消耗1 μmol NADH所需酶量為1個(gè)酶活力單位(單位：U/mL)．

酶活力單位=(VT×ΔD×K)/(ε×VS×L)

(1)

其中，VT為反應(yīng)液總體積；VS為抽提液樣品體積； ΔD為每分鐘光密度變化值；K為樣品稀釋倍數(shù)；ε為摩爾吸光系數(shù)，ε=6.22 L/(mmol·cm)；L為樣品中的光程，L=0.5 cm．

1.3 手性胺的催化合成與產(chǎn)物分析

AmDH-FDH催化生成手性胺的反應(yīng)體系包括：200 mmol/L的氯化銨-氨水緩沖液(pH=9.5)、20 mmol/L的苯氧基-2-丙酮、50 mmol/L的甲酸銨和0.05 mmol/L的NAD+．將上述溶液置于冰上，以氨水調(diào)節(jié)體系pH=9.5，加入適量的AmDH與FDH，于30 ℃、200 r/min條件下反應(yīng)，每隔一段時(shí)間取樣保存于-80 ℃待分析．

產(chǎn)物分析：將樣品置于沸水浴中15 min后，于1.3×104g離心10 min去除蛋白質(zhì)沉淀，加入等體積的正己烷萃取產(chǎn)物，搖勻，低速離心2 min，取上清，重復(fù)萃取3次，合并萃取液，以0.22 μm濾膜過(guò)濾2次后用于高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)分析．底物酮濃度和產(chǎn)物胺的濃度及光學(xué)純度以Chiral CEL OD-H液相色譜柱進(jìn)行分析．

高效液相色譜條件為：流動(dòng)相V(正己烷)∶V(乙醇)∶V(乙二胺)=90∶10∶0.1， 柱溫為35 ℃，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm．

2 結(jié)果與分析

2.1 胺脫氫酶的酶學(xué)性質(zhì)及動(dòng)力學(xué)性質(zhì)

氧化還原酶與輔酶再生酶的耦聯(lián)體系中，耦聯(lián)并不是單純的混合，而是基于各個(gè)酶單獨(dú)的反應(yīng)條件，即基于酶的活性和穩(wěn)定性等因素來(lái)選擇多酶體系的反應(yīng)條件；各個(gè)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的匹配，綜合考慮酶濃度配比、輔酶與底物的配比，以及輔酶循環(huán)效率等因素．同時(shí)，還要考慮到底物抑制和產(chǎn)物抑制等限制因素．因此，本研究分別測(cè)定了AmDH與FDH的酶學(xué)性質(zhì)及其動(dòng)力學(xué)參數(shù)．

利用HiSTrap HP柱對(duì)分別重組AmDH與FDH進(jìn)行純化得到純酶，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析其純度，結(jié)果如圖1，兩個(gè)酶的理論大小分別為41.5 kDa(ku)和42 kDa(ku)，電泳結(jié)果符合預(yù)期．

圖1 AmDH和FDH的SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified AmDH and FDH

圖2為AmDH及FDH的最適溫度及最適pH值的測(cè)定結(jié)果．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， FDH的最適溫度為30 ℃，而AmDH的最適溫度為35 ℃．對(duì)于FDH而言，溫度對(duì)活性的影響并不大，35 ℃時(shí)，其活性能夠達(dá)到最適溫度條件下活性的90 %，因此，對(duì)于耦聯(lián)體系的溫度，選擇AmDH的最適溫度，該條件下FDH也保持了較高的酶活力．通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究pH值分別對(duì)AmDH及FDH酶活的影響，結(jié)果如圖2(c)和(d)．由圖2(c)和 (d)可見，兩個(gè)酶均是在堿性條件下催化反應(yīng)，AmDH的最適pH=9.5，F(xiàn)DH的最適pH=8.0，兩酶的最適pH值相近，有利于雙酶耦聯(lián)體系的構(gòu)建．雙酶參與的反應(yīng)是在同一反應(yīng)pH值下發(fā)生的，這意味著pH值的選擇會(huì)犧牲掉某個(gè)酶的部分活力，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的FDH活性高于AmDH，且FDH在pH=9.5條件下仍能保持80%的最高活性．同時(shí)，耦聯(lián)體系是以AmDH反應(yīng)為主體，因此采用能夠?yàn)轶w系提供游離氨的氯化銨-氨水緩沖液．耦聯(lián)反應(yīng)的催化條件為35 ℃，pH=9.5的氯化銨-氨水緩沖液．

對(duì)純化的AmDH及FDH分別以苯氧基-2-丙酮和甲酸銨為底物，測(cè)定2個(gè)酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)．反應(yīng)體系中苯氧基-2-丙酮的濃度為1.25～60 mmol/L，甲酸銨的濃度為1.25～100 mmol/L，在其他條件相同的情況下，測(cè)定不同底物濃度下的AmDH及FDH酶活力，根據(jù)Michaelis-Menten方程計(jì)算米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax(表1)．Km是表征酶與底物之間親和力的常數(shù)，Km越小，表示酶與底物之間的親和力越大，即達(dá)到最大反應(yīng)速率1/2時(shí)所需要的酶量越小；kcat表示在最優(yōu)條件下酶催化生成底物的速率．在表1中，根據(jù)動(dòng)力學(xué)特征計(jì)算得到AmDH底物苯氧基-2-丙酮的Km=18.49 mmol/L，Vmax=0.22 mmol/(min·mL)，F(xiàn)DH底物的Km=13.1 mmol/L，Vmax=0.23 mmol/(min·mL)．FDH的Km(NAD+)與AmDH的Km(NADH)數(shù)值相近，可以推測(cè)，在FDH與AmDH的耦聯(lián)反應(yīng)體系中，F(xiàn)DH對(duì)氧化型輔酶NAD+的需求量與AmDH對(duì)還原型輔酶NADH的需求量相當(dāng)．kcat/Km的值是衡量一個(gè)酶催化效率的最重要參數(shù)，也是考慮了酶轉(zhuǎn)化底物的最大速率與酶與底物之間親和力的一個(gè)綜合參數(shù).

圖2 AmDH和FDH的酶學(xué)性質(zhì)(以各自最高酶活力為100%計(jì)算)Fig.2 The enzymatic property of AmDH and FDH (calculated by the maximum activity of 100%)

表1 AmDH及FDH的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of AmDH and FDH

根據(jù)文獻(xiàn)[15]研究工作，測(cè)定了AmDH游離酶及固定化酶在不同溫度下的穩(wěn)定性(圖3)，隨著溫度的提高，游離AmDH的失活速度越快． AmDH的穩(wěn)定性不是很好，其游離AmDH在60 ℃下孵育5 min即失活；AmDH-PEI復(fù)合物的在60 ℃下孵育20 min仍可保存20%的活性，而AmDH-PEI-TiO2固定化酶則在60 ℃下孵育30 min仍可保存20%的活性．而FDH的穩(wěn)定性較好，其游離酶可在60 ℃下保存30 min仍存有30%的反應(yīng)活性[16]．兩個(gè)酶相比較而言，在30 ℃條件下，F(xiàn)DH比較穩(wěn)定，且酶活力在反應(yīng)后期的變化不是很大；而AmDH的穩(wěn)定性較差，在反應(yīng)初期存在一定的活性降低，中間有較長(zhǎng)一段時(shí)間的穩(wěn)定過(guò)程，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)120 min后，AmDH僅保留10%左右的活性．而且FDH的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于AmDH，AmDH催化的還原胺化反應(yīng)是整個(gè)耦聯(lián)體系催化的限速步驟，因此，耦聯(lián)體系的構(gòu)建初始并未考慮酶穩(wěn)定性的問(wèn)題．

圖3 AmDH、游離酶FDH與不同固定化酶的溫度穩(wěn)定性(60 ℃)Fig.3 Thermal stabilities of the free and different immobilized AmDH and FDH(at 60 ℃)

2.2 游離胺脫氫酶-甲酸脫氫酶耦聯(lián)體系的構(gòu)建

在雙酶耦聯(lián)的催化反應(yīng)體系中，涉及到兩個(gè)酶各自催化的氧化還原反應(yīng)，它們各自催化氧化或還原底物，周而復(fù)始的實(shí)現(xiàn)輔酶NADH的再生與消耗，既相互獨(dú)立又相互影響．由于涉及到兩個(gè)同時(shí)發(fā)生的氧化還原反應(yīng)，這使得協(xié)調(diào)兩個(gè)酶各自催化反應(yīng)的速率，進(jìn)而使提高酶催化效率的過(guò)程變得更加重要．如果一個(gè)反應(yīng)速率過(guò)快或過(guò)慢，勢(shì)必會(huì)對(duì)總體的催化效率及輔酶循環(huán)效率產(chǎn)生不利的影響．純酶催化體系可以通過(guò)在體系中調(diào)節(jié)適當(dāng)比例的雙酶濃度，使參與反應(yīng)的兩個(gè)酶保持較高的催化效率．因此，實(shí)驗(yàn)中研究了酶濃度配比、底物濃度和輔酶濃度對(duì)游離雙酶耦聯(lián)體系的影響．

圖4 c(AmDH)/c(FDH)、輔酶濃度、底物濃度對(duì)生物催化過(guò)程的影響Fig.4 Effects of AmDH/FDH ratio, coenzyme and substrate concentration on biocatalytic process

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中檢測(cè)到的FDH活性遠(yuǎn)高于AmDH，因此，AmDH的催化反應(yīng)是整個(gè)催化過(guò)程中的限速步驟，在體系中提高AmDH酶和FDH酶濃度比，即提高c(AmDH)/c(FDH)比值， 會(huì)大大加速反應(yīng)的初速度．但AmDH與FDH的酶穩(wěn)定性不同也會(huì)影響耦聯(lián)體系催化的過(guò)程，如圖4(a)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶濃度對(duì)于反應(yīng)速率的影響逐漸減小，最終反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率沒(méi)有明顯差異，原因可能是隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，AmDH的活性逐漸下降，對(duì)反應(yīng)的催化作用減弱．由圖4(b)可見，隨著輔酶NAD+濃度的升高，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化效率明顯下降．原因可能是體系中的輔酶NAD+同時(shí)參與AmDH的氧化脫氨反應(yīng)，隨著輔酶NAD+濃度的升高，產(chǎn)物氧化脫氨的速率加快，導(dǎo)致了產(chǎn)物的總生成速率下降．同樣，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，AmDH的活性下降，輔酶濃度對(duì)于反應(yīng)速率的影響逐漸下降，且對(duì)轉(zhuǎn)化率無(wú)明顯影響．由圖4(c)可見，隨著底物濃度的升高，產(chǎn)物的生成速率升高，但是最終反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率會(huì)明顯降低．原因可能是酶的結(jié)合位點(diǎn)有限，隨著底物濃度升高，反應(yīng)速率會(huì)達(dá)到飽和，同時(shí)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，AmDH活性逐漸降低，催化效果下降，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低．分析雙酶濃度比、底物濃度和輔酶濃度對(duì)游離雙酶耦聯(lián)體系的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，AmDH酶的穩(wěn)定性會(huì)大大影響耦聯(lián)體系的反應(yīng)速率及轉(zhuǎn)化率，因此，提高AmDH的穩(wěn)定性成為影響耦聯(lián)體系催化效率的重要因素．

2.3 固定化胺脫氫酶-甲酸脫氫酶體系的構(gòu)建

PEI是一種水溶性的大分子聚胺，鏈上擁有大量的氨基(支鏈PEI，分子鏈上有伯仲叔胺)．PEI上帶有大量的氨基，當(dāng)pH<10時(shí)，其分子鏈上的氨基多處于質(zhì)子化狀態(tài)，而AmDH與FDH在pH<10時(shí)帶負(fù)電，所以，PEI對(duì)酶分子具有一定的靜電吸引作用，能夠通過(guò)靜電作用使酶分子發(fā)生離子吸附而被固定化[17]．PEI如“繩子”一般纏繞在酶分子表面，能夠在一定程度上抑制多亞基酶亞基之間的解離．同時(shí)，PEI可以作為模板和催化劑催化鈦前驅(qū)體水解縮聚形成二氧化鈦[14]，進(jìn)一步固定化已經(jīng)被PEI包裹的酶分子，提高酶分子的穩(wěn)定性．

根據(jù)文獻(xiàn)[15]工作，選擇pH=8.5的PEI對(duì)AmDH-FDH進(jìn)行包裹，使PEI終濃度達(dá)到0.25 mmol/L時(shí)，酶的活力達(dá)到最大，且穩(wěn)定效果也最好．利用AmDH-FDH-PEI復(fù)合體作為誘導(dǎo)劑催化鈦前驅(qū)體Ti-BLADH水解縮聚形成包裹著酶分子的TiO2顆粒球．如表2，對(duì)3種耦聯(lián)體系來(lái)講，底物濃度不變時(shí)，輔酶濃度提高，總轉(zhuǎn)化率(total turnover number, TTN)值會(huì)下降，說(shuō)明輔酶重復(fù)利用率會(huì)下降．固定輔酶濃度，提高底物濃度雖然會(huì)提高反應(yīng)速率，但是轉(zhuǎn)化率會(huì)明顯降低．

表2 底物濃度與輔酶濃度對(duì)于游離體系及兩種固定化多酶耦聯(lián)體系的影響Table 2 Effects of the concentration of substrate and coenzyme on the free system and immobilized multi-enzyme coupling system

綜合考慮輔酶的利用率和底物的轉(zhuǎn)化率，選擇輔酶濃度為0.025 mmol/L、底物濃度為10 mmol/L作為最適反應(yīng)條件做進(jìn)一步研究．其反應(yīng)過(guò)程的進(jìn)程曲線如圖5．耦聯(lián)體系剛開始反應(yīng)時(shí)，游離體系的轉(zhuǎn)化率最高，但隨著時(shí)間的推移，游離酶活性逐漸降低，轉(zhuǎn)化率隨之下降，而其他兩種固定化酶耦聯(lián)體系能夠較好地維持反應(yīng)速率．PEI固定化體系雖然能夠在一定程度上抑制酶亞基的解離，進(jìn)而穩(wěn)定酶的活性，但是，PEI與酶分子之間是通過(guò)靜電作用吸附而交聯(lián)固定的，其過(guò)程是可逆的．而AmDH-FDH-PEI復(fù)合物誘導(dǎo)鈦前驅(qū)體Ti-BALDH形成的TiO2包裹的耦聯(lián)體系，是化學(xué)反應(yīng)，形成了有限空間的“籠效應(yīng)”，并為催化反應(yīng)提供了適宜的微環(huán)境，其耦聯(lián)體系酶活力得以保存，因此，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)有更好的催化能力．輔酶可在固定化酶體系所創(chuàng)造的微環(huán)境中高效循環(huán)再生，因而提高了多酶耦聯(lián)體系的催化效率．

圖5 游離體系、PEI固定化體系和仿生礦化固定化體系的反應(yīng)時(shí)間-轉(zhuǎn)化率曲線Fig.5 Reaction time conversion curve of free system, PEI immobilized system and biomimetic mineralization immobilized system

實(shí)驗(yàn)過(guò)程均采用純酶進(jìn)行反應(yīng)，其產(chǎn)物均為R-苯氧基-2-丙胺，未能檢測(cè)到S型產(chǎn)物，3種耦聯(lián)體系反應(yīng)在產(chǎn)物光學(xué)純度上都表現(xiàn)出較好的對(duì)映體純度 (對(duì)映體過(guò)量值>99.9%)．

結(jié) 語(yǔ)

通過(guò)分別研究AmDH與FDH的單酶理化與動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，并基于以上性質(zhì)對(duì)參與耦聯(lián)體系的雙酶的酶活力配比、底物濃度和輔酶濃度進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高效經(jīng)濟(jì)的輔酶再生循環(huán)．采用PEI對(duì)耦聯(lián)體系進(jìn)行固定化，并進(jìn)一步利用PEI-酶復(fù)合物誘導(dǎo)鈦前驅(qū)體Ti-BALDH水解縮聚形成TiO2，同時(shí)包裹PEI-AmDH-FDH形成固定化耦聯(lián)體系．兩種固定化方法過(guò)程簡(jiǎn)單，所需時(shí)間短，固定化后的酶保持了較高的酶活，同時(shí)具有更高的穩(wěn)定性．相比游離酶耦聯(lián)體系，固定化耦聯(lián)酶體系可以在低底物濃度和低輔酶濃度條件下保持較高的催化效率．