張?jiān)蛮i，陳 芳，黃 珂，王帥珂，王 瑞

1)聊城大學(xué)藥學(xué)院，山東聊城 252000；2)聊城市第四人民醫(yī)院，山東聊城 252000

氫離子(H+)是重要的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)之一，許多疾病與細(xì)胞內(nèi)異常的H+濃度有關(guān)[1-3]，因此，構(gòu)建優(yōu)秀的pH熒光探針用于準(zhǔn)確跟蹤和監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)pH值的波動(dòng)具有重要的意義[4]． 目前， 大多數(shù)熒光pH探針適用于弱酸性細(xì)胞器或近中性的細(xì)胞質(zhì)[5-8]，而用于極酸性環(huán)境(pH<4)的pH熒光探針十分稀缺．雖然極酸性環(huán)境對(duì)大多數(shù)的生命體是致命的[9]，但是一些原核細(xì)胞不僅可以在極酸性的環(huán)境下生存[10]，還能打破生命體防御機(jī)制并導(dǎo)致許多的疾病．例如，胃液的pH值為1.5～2.5，胃腸道細(xì)菌如幽門螺旋桿菌會(huì)導(dǎo)致胃潰瘍，甚至胃癌[11]；弧菌霍亂導(dǎo)致嘔吐腹瀉，大量水分的流失最終會(huì)使人體的循環(huán)系統(tǒng)崩潰[12]；大腸桿菌易引起血性腹瀉，嚴(yán)重的會(huì)引發(fā)腎衰竭導(dǎo)致死亡[13-14]．此外，在真核細(xì)胞中，酸性條件對(duì)于細(xì)胞器中的內(nèi)吞和分泌途徑起著關(guān)鍵的作用[15]．因此，本研究選用咪唑并[1,2-a]吡啶類化合物作為受體，以雙鍵作為橋梁連接供電體，設(shè)計(jì)合成了適用于極酸性環(huán)境的pH熒光探針，并測試其紫外吸收和熒光發(fā)射光譜性能，計(jì)算其解離常數(shù)pKa值，確定適用的pH值范圍．合成路線如圖 1．

圖1 10-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-3-(2-(2-苯基咪唑并[1,2-a]吡啶-7-基)乙烯基)-10H-吩噻嗪的化學(xué)合成路線Fig.1 Synthetic route of 10-(2-(2-methoxyethoxy)ethyl-3-(2-(2-phenylimidazo[1,2-a]pyridin-7-yl)vinyl)-10H-phenothiazine

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)試劑均為市售化學(xué)純或者分析純產(chǎn)品，所需測試的樣品溶劑均在測試之前配制；四甲基硅烷(tetramethyl silane, TMS)為內(nèi)標(biāo)．Bruker-advanced Ⅲ400 核磁共振儀購自美國Bruker公司；飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀購自美國Evisa公司；UV-300紫外分光光度計(jì)購自美國Varian Cary公司；PTI-QM4熒光分光光度計(jì)購自美國PTI公司；Orion A420 pH計(jì)購自美國Thermo Scientific公司．

1.2 化合物3的合成

1.2.1 化合物1的合成[16]

將0.20 g(0.01 mmol)2-溴苯乙酮、0.11 g (0.01 mmol)2-氨基-4-甲基吡啶和0.84 g(0.01 mol)NaHCO3溶于20 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液中，回流攪拌20 h．冷卻至室溫，過濾，濾餅用乙醚洗滌，真空干燥，得到黃色固體 0.15 g，為化合物1，即7-甲基-2-苯基咪唑并[1,2-a]吡啶產(chǎn)率70 %．

1.2.2 化合物3的合成

將0.33 g(0.001 mol)的10-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-10H-酚噻嗪-3-甲醛與0.13 g(0.001 mol)的對(duì)氯苯胺溶于20 mL甲醇溶液中，常溫下攪拌，析出白色固體化合物2為(N-(4-氯苯基)-1-(10-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基-10H-吩噻嗪-3-基)甲亞胺)．將未經(jīng)純化的化合物2與0.21 g(0.001 mol)化合物1、1.2 g(0.01 mol)叔丁醇鉀直接溶于20 mL N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide, DMF)中，90 ℃下加熱反應(yīng)20 h．冷卻至室溫，減壓除去溶劑，剩余固體經(jīng)硅膠色譜柱層析分離，洗脫劑V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1，得到0.31 g淡黃色固體，產(chǎn)率為60%．氫(1H)核磁共振譜(1H nuclear magnetic resonance,1H NMR) (400 MHz, CDCl3) 化學(xué)位移δ(mg/L)分別為：3.39 (s, 3H)、4.13 (t, 耦合常數(shù)J=6.0 Hz, 2H)、3.86 (t,J=6.0 Hz, 2H)、3.66 (t,J=6.0 Hz, 2H)、3.56 (t,J=4.0 Hz, 2H)、6.88～7.04 (m, 6H)、7.12～7.15 (m, 2H)、7.28～7.30 (m, 2H)、7.34 (t,J=8.0 Hz, 1H)、7.44 (t,J=8.0 Hz, 2H)、7.59 (s, 1H)、7.81 (s, 1H)、7.97 (d,J=8.0 Hz, 2H)和8.05 (d,J=8.0 Hz, 1H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ(mg/L)分別為：45.6、47.2、58.1、67.4、69.7、71.2、109.4、109.6、114.1、115.8、122.7、122.8、123.6、124.7、125.4、125.5、126.5、127.1、127.7、128.7、131.5、133.8、134.3、144.0、144.1、145.0和145.3. 通過高分辨電噴霧質(zhì)譜得到C32H30N3O2S[M+H]+分子量理論值為520.205 9, 實(shí)測分子量為520.207 1，確定該物質(zhì)為化合物3，其化學(xué)式為C32H29N3O2S.

1.3 待測液的配置

準(zhǔn)確稱取適量的化合物3，溶于25 mL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)中，配成濃度為1.0 mmol/L儲(chǔ)備溶液，配置不同濃度的鹽酸溶液(0.25、0.5和1.0 mol/L)，移取4 mL的儲(chǔ)備液并通過二甲基亞砜-水體系(體積比為1∶5)將溶液稀釋至10 μmol/L，通過加入微量不同濃度的鹽酸溶液得到一系列不同的pH值溶液用于紫外和熒光光譜的測定．

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物3的合成物點(diǎn)

化合物1的制備，反應(yīng)簡單，反應(yīng)后直接生成沉淀，無須進(jìn)一步純化，適合大量制備，直接進(jìn)行下一步的反應(yīng)操作．化合物2通過醛基和氨基縮合反應(yīng)制備，反應(yīng)在常溫下進(jìn)行，不需要惰性氣體保護(hù)，方便安全，攪拌后得到白色的沉淀，過濾干燥即可進(jìn)行下一步的反應(yīng)．化合物3由化合物1和2在強(qiáng)堿的參與下反應(yīng)得到，反應(yīng)時(shí)間較長產(chǎn)率不高，主要因?yàn)榛衔镏休^大的π共軛結(jié)構(gòu)降低了電子云密度，不利于反應(yīng)進(jìn)行．

2.2 化合物3的紫外-可見吸收光譜

圖2 化合物3在不同的pH值下的紫外-可見吸收光譜Fig.2 UV absorption spectra of compound 3 at different pH values

化合物3在pH值為0.4～7.0溶液中的紫外-可見吸收光譜如圖2．由圖2可見，化合物3在中性條件下(pH=7.0)有一個(gè)吸收帶，λmax=399 nm，溶液為淡黃色．隨溶液pH值降低，化合物3在399 nm的最大吸收峰強(qiáng)度逐漸降低，并伴隨紅移逐漸在419 nm出現(xiàn)一個(gè)新的吸收帶．溶液pH = 0.4時(shí)，化合物3在399 nm處的吸收峰完全消失，且溶液變?yōu)槌赛S色．因?yàn)檫溥虿1,2-a]吡啶上的氮原子有孤對(duì)電子，可以與氫質(zhì)子相結(jié)合，當(dāng)?shù)颖毁|(zhì)子化后，咪唑并[1,2-a]吡啶以陽離子的形態(tài)而存在，具有吸電子效應(yīng)，而吩噻嗪分子內(nèi)π-π共軛使電子云密度增強(qiáng)，因此,隨環(huán)境pH值的降低，化合物3分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)增強(qiáng)，紫外吸收峰紅移．

2.3 化合物3的熒光發(fā)射光譜

化合物3在pH值為0.4～7.0溶液中的熒光發(fā)射光譜如圖3．

圖3 化合物3在不同的pH值條件下的熒光發(fā)射光譜Fig.3 Fluorescence emission spectra of compound 3 at different pH values

當(dāng)溶液pH值從7.0降到0.4時(shí)，化合物3在573 nm的熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸減弱，熒光強(qiáng)度的最大相差倍數(shù)超過了130倍．主要因?yàn)樵谒嵝詶l件下，咪唑并[1,2-a]吡啶上的氮發(fā)生了質(zhì)子化反應(yīng)，化合物以陽離子的形態(tài)存在，從而形成了強(qiáng)吸電子效應(yīng)，使得吩噻嗪分子上的電子經(jīng)過雙鍵進(jìn)行傳遞，光誘導(dǎo)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)增強(qiáng)，熒光基團(tuán)在激發(fā)態(tài)時(shí)進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，使得熒光強(qiáng)度逐漸減弱．在pH=7.0時(shí)化合物3的相對(duì)熒光量子產(chǎn)率Φ=0.150， 而在pH=0.4時(shí)Φ=0.005． 通過在573 nm的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨pH值變化曲線進(jìn)行Sigmoidal擬合求得化合物3的pKa值．如圖4，化合物3的pKa=3.07，說明作為pH熒光探針可以適用于極酸性環(huán)境．

圖4 化合物3在573 nm處的熒光強(qiáng)度與pH值的關(guān)系Fig.4 Relationship between fluorescence intensity of compound 3 at 573 nm and pH value

2.4 化合物3的光穩(wěn)定性和光可逆性研究

探針在生物體中的表征需要使用共聚焦激光掃描顯微鏡，因此不同波段的高能量激光對(duì)于探針的穩(wěn)定性有較高的要求．對(duì)不同pH值下化合物3的光穩(wěn)定性進(jìn)行研究，隨著時(shí)間的推移，化合物3沒有熒光衰減的情況，如圖5．可逆性能使探針監(jiān)測到細(xì)微的pH值變化，在生物成像時(shí)提供更多細(xì)微詳細(xì)的生物信息．圖6表明，化合物3在極酸和中性的條件下可以對(duì)H+完全響應(yīng)，且?guī)缀跏羌磿r(shí)完全轉(zhuǎn)換．說明pH熒光探針可在極短時(shí)間內(nèi)根據(jù)工作環(huán)境的微小變化進(jìn)行即時(shí)監(jiān)測，且在連續(xù)的酸堿環(huán)境變化下保持穩(wěn)定的工作狀態(tài)．

圖5 不同的pH值下化合物3的光穩(wěn)定性Fig.5 Photostability of compound 3 at different pH value

圖6 pH=7.0和pH=0.4時(shí)化合物3的可逆性Fig.6 Reversibility of compound 3 at pH=7.0 and pH=0.4

圖7 化合物3與H+結(jié)合方式Fig.7 Combination of compound 3 and H+

2.5 化合物3與H+結(jié)合機(jī)理

化合物3對(duì)不同pH值的響應(yīng)通過咪唑并[1,2-a]吡啶上的N原子與H+的結(jié)合產(chǎn)生(圖7)，為驗(yàn)證這一結(jié)合方式，進(jìn)行了核磁滴定實(shí)驗(yàn)．如圖8(a)至(e)所示，當(dāng)H+的濃度越大時(shí)，咪唑并[1,2-a]吡啶上氮原子吸收H+化合物中的越多，吸電子效應(yīng)增強(qiáng)．咪唑并[1,2-a]吡啶上的H11和H13向低場移動(dòng)，氫原子序號(hào)和位置如圖8，而其他碳上的氫原子受到的影響較小從而保持化學(xué)位移不變．

(a)加入1.5倍的n(H+)；(b)加入1倍n(H+)；(c)加入0.5倍n(H+)；(d)加入0.25倍n(H+)；(e)無n(H+)；(f)C32H29N3O2S圖8 化合物3的核磁共振氫譜Fig.8 1H NMR spectra of compound 3

結(jié) 語

本研究合成了10-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-3-(2-(2-苯基咪唑并[1,2-a]吡啶-7-基)乙烯基)-10H-吩噻嗪， 通過對(duì)其光譜性質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)該化合物可作為一種新型的 pH熒光探針．此外，該化合物的pKa=3.07，作為pH熒光探針可適用于極酸性環(huán)境，其進(jìn)一步的應(yīng)用還在研究中．