凌文康，黃慧煒，劉 冰，鄧 旭

深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東深圳 518055

近年來由于工業(yè)活動(dòng)多樣化，環(huán)境中的重金屬污染問題日益嚴(yán)重[1]．在冶金、石油化工、電池、聚氯乙烯和采礦等生產(chǎn)活動(dòng)中常產(chǎn)生多種有毒金屬殘留物，嚴(yán)重污染環(huán)境[2]．重金屬離子，如汞、鎘、鉻和銀等，在極低濃度下就會(huì)對生命體產(chǎn)生極大的毒性[3]．不僅如此，重金屬污染具有來源廣、殘留時(shí)間長、有蓄積性、可沿生物鏈富集放大、污染后不易被檢測，以及難以被微生物降解等缺點(diǎn)[4]．傳統(tǒng)的有毒金屬陽離子的環(huán)境修復(fù)技術(shù)通常采用物理、化學(xué)和生物的方法，這些技術(shù)不僅處理效果有限、成本高昂，還易產(chǎn)生二次污染物[5]．生物吸附法作為一種新興的重金屬去除技術(shù)，愈來愈受到人們的關(guān)注[6]．生物吸附法通過游離或固定化的活體或滅活生物材料去除廢水中的有毒物質(zhì)，回收有用成分，具有成本低、效率高、選擇性好、無二次污染及可回收貴重金屬等優(yōu)點(diǎn)[7]．

海洋動(dòng)物如貝類和魚類等?？捎糜谥甘旧锖饬亢Ｑ蟓h(huán)境的重金屬污染[8]．貽貝是一種廣泛分布于沿海和近海的甲殼類海洋生物，其足絲腺能分泌足絲，并通過足絲形成的足絲盤將自身固定在各種固體基材(如巖石)表面，并伴隨海水的沖刷吸附各種重金屬[9]．WAITE等[10]研究表明，這與貽貝分泌的足絲有關(guān)，其足絲的主要成分是貽貝足絲蛋白．在生物醫(yī)學(xué)、表面化學(xué)[11]和海洋工程[12]等領(lǐng)域中，足絲蛋白都已被廣泛應(yīng)用．雖然足絲分泌的足絲蛋白黏附重金屬的能力已經(jīng)備受關(guān)注，但對足絲蛋白黏附重金屬的機(jī)理研究尚未見報(bào)道．本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析翡翠貽貝足絲蛋白，構(gòu)建翡翠貽貝足絲蛋白基因重組菌，探討翡翠貽貝足絲蛋白對Hg和Cd富集機(jī)制和行為．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與載體

高表達(dá)載體pET-30a由深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供．E.coliBL21(DE3)購于上海唯地生物技術(shù)有限公司．

1.1.2 主要試劑

TaKaRa質(zhì)粒DNA小量試劑盒、TaKaRa DNA凝膠回收試劑盒、TaKaRa LA Taq Hot Start Version、TaKaRa QuickCut NdeⅠ限制性內(nèi)切酶、TaKaRa QuickCut Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶、TaKaRa T4 DNA 連接酶，以上試劑盒及試劑均購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司．卡那霉素、異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)、LB培養(yǎng)基(lysogeny broth medium)∶NaCl 10 g/L；酵母提取物(bacto-yeast extract)5 g/L；蛋白胨(bacto-tyrptone)10 g/L.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 翡翠貽貝足部組織轉(zhuǎn)錄組測序

提取翡翠貽貝足部組織的total RNA和轉(zhuǎn)錄組測序由深圳華大基因研究院完成．使用Illumina公司Hiseq2000測序平臺(tái)，采用90 bp雙端測序方法(paired-end)進(jìn)行RNA-seq測序．得到數(shù)據(jù)后首先采用FastQC軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估；然后對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，去除含有接頭的測序片段(reads)，去除未知堿基(堿基N)比例高于5%的reads，去除低質(zhì)量reads(read中質(zhì)量值<10的堿基含量高于50%)，得到干凈片段(clean data)；最后采用短序列拼接軟件Trinity對clean data進(jìn)行序列拼接組裝，得到轉(zhuǎn)錄本序列．

1.2.2 編碼基因pvfp6的PCR擴(kuò)增及質(zhì)粒的提取

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序所得的pvfp6基因序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)，上游引物為5’ GGATCCGGTGTTTACATCCC 3’，引入NdeⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物為5’CTCGAGTTTGTAACCGTAAC3’，引入Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)．pvfp6基因的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后；72 ℃再延伸7 min．瓊脂糖凝膠電泳觀察分析擴(kuò)增結(jié)果，切膠回收目的基因．

在37 ℃，200 r/min條件下，以0.1%的接種量培養(yǎng)含pET-30a的宿主菌，14～16 h后按照TaKaRa質(zhì)粒DNA小量試劑盒的實(shí)驗(yàn)方法步驟提取質(zhì)粒，取1～2 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，取2 μL在分光光度計(jì)中測定濃度．

1.2.3pvfp6基因工程菌的構(gòu)建

用NdeⅠ和Hind Ⅲ雙酶切pvfp6基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pET-30a，取5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0分別切膠回收約300 bp、5 000 bp的DNA片段；使用T4 DNA Ligase連接目的基因和載體，得到重組質(zhì)粒pET-30a-pvfp6，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)．

1.2.4 重組質(zhì)粒的驗(yàn)證與蛋白表達(dá)

從轉(zhuǎn)化的平板中挑取單克隆，接種到30 mL的LB培養(yǎng)基中(含100 μg/mL的卡那霉素)，用20%的甘油進(jìn)行菌種保藏．為進(jìn)一步驗(yàn)證所得的重組質(zhì)粒是否為陽性，首先用pvfp6的引物以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，電泳檢測分別得到約 300 bp的條帶，與原 PCR 產(chǎn)物大小一致．所得樣品送華大基因測序．

將驗(yàn)證正確的重組菌以0.1%的接種量分別接種到30 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng)，再以1%的接種量接種到新的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)，待培養(yǎng)至D(600)為0.5～0.8時(shí)，添加IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，并置于37 ℃搖床中誘導(dǎo)表達(dá)．取誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液12 000 g離心5 min，去除上清液，加入磷酸鹽緩沖液重懸沉淀，最后加入SDS-PAGE上樣緩沖液，于100 ℃加熱樣品10 min，離心取上清電泳．電泳前10 min以100 V穩(wěn)壓電泳，待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后200 V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍(lán)帶遷移至離凝膠底部1 cm，取出凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色，隨后轉(zhuǎn)入脫色液中，脫色至背景清晰．

1.2.5 重組菌對Hg2+和Cd2+生長抗性及富集研究

把各重組菌及對照菌以0.1%的接種量，接到液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min振蕩過夜培養(yǎng)(12～16 h)．其中，培養(yǎng)重組菌和對照菌的培養(yǎng)基添加了100 μg/mL卡那霉素．以1%的接種量轉(zhuǎn)接到新的液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至D(600)值為0.5～0.7(約2.5 h)時(shí)添加IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)4 h后，以2%的接種量將重組菌和對照菌分別接種到添加不同Hg2+和Cd2+質(zhì)量濃度的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)．每組每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，每隔4 h測量其D(600)值． 另外， 將一定的菌體懸浮后分別投入不同離子濃度的Hg2+和Cd2+溶液中，30 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)2 h，離心收集菌體后，利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測定上清中Hg2+和 Cd2+的質(zhì)量濃度[13]．

2 結(jié)果與討論

2.1 高通量測序以及轉(zhuǎn)錄組的篩選與功能注釋

對翡翠貽貝足部組織提取的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得55 670 668個(gè)原始數(shù)據(jù)(raw reads)，測序質(zhì)量值Q20=98.19%， GC值為42.18%．通過過濾，獲得53 047 718個(gè)clean reads，使用Trinity軟件進(jìn)行從頭組裝，獲得73 571個(gè)廣泛通用的基因數(shù)據(jù)庫(Universal Genes，UniGenes)．將翡翠貽貝足部的UniGenes注釋到基因本體(gene ontology, GO)數(shù)據(jù)庫，共獲得9 466個(gè)注釋結(jié)果，并分為51個(gè)亞類，這51個(gè)亞類歸屬于生化進(jìn)程、細(xì)胞組成和分子功能3個(gè)功能．進(jìn)一步通過KEGG注釋后，發(fā)現(xiàn)有955個(gè)UniGenes被注釋到黏著斑通路中，推測足絲蛋白黏附重金屬的功能與其密切相關(guān)．綜合來看，GO和KEGG途徑的注釋為進(jìn)一步明確翡翠貽貝中特定細(xì)胞結(jié)構(gòu)、通路和蛋白質(zhì)功能提供了有用信息．

將實(shí)驗(yàn)得到的翡翠貽貝足部轉(zhuǎn)錄組和已公布的紫貽貝足絲蛋白序列進(jìn)行blastx同源性搜索，結(jié)果如表1．最終挑選序列長度適中，半胱氨酸、組氨酸、酪氨酸含量高的足絲蛋白Pvfp6進(jìn)行后續(xù)研究．

Pvfp6分子質(zhì)量約為11 ku，pH(I)=5.60，其信號(hào)肽由17個(gè)氨基酸殘基組成，主要涉及足絲蛋白的分泌機(jī)制．Pvfp6富含14%的半胱氨酸和8.2%的酪氨酸．半胱氨酸具有金屬結(jié)合能力和氧化還原活性，將結(jié)合的重金屬螯合成無毒的配合物，起到降解重金屬毒性的作用[14]．黏附蛋白序列中的酪氨酸具有羥基化的翻譯后修飾特征，其被羥基后形成3，4-二羥基苯丙氨酸(3，4-dihydroxyphenyl alanine，DOPA，多巴)，正是DOPA的存在才賦予了貽貝足絲蛋白強(qiáng)的黏附功能以及對重金屬等可能具有的吸附作用[15]．

2.2 基因 pvfp6的PCR擴(kuò)增及連接

按照1.2.2節(jié)的方法得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物．編碼基因pvfp6的PCR產(chǎn)物在300 bp處出現(xiàn)條帶，與轉(zhuǎn)錄組測序所得基因大小一致．提取pET-30a質(zhì)粒后，將pvfp6的PCR產(chǎn)物定向克隆至pET-30a中，構(gòu)成重組質(zhì)粒．

2.3 pvfp6基因重組子的驗(yàn)證

將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布在含有100 μg/mL卡那霉素的LB平板上過夜培養(yǎng)菌體．挑取重組菌單菌落轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，再將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳．如圖1，重組菌在300 bp處出現(xiàn)條帶，說明所挑取單菌落轉(zhuǎn)化子為陽性重組菌．最后，把重組菌的質(zhì)粒分別送去測序．將已轉(zhuǎn)入pvfp6基因的陽性重組子命名為P6．測序結(jié)果顯示，P6重組菌成功構(gòu)建，沒有發(fā)生任何堿基突變．

圖1 重組質(zhì)粒 pvfp6的PCR產(chǎn)物電泳檢測Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product of target gene pvfp6

2.4 Pvfp6蛋白的表達(dá)

對重組菌P6(含pET-30a-pvfp6)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以轉(zhuǎn)入空載體pET-30a的E.coli. BL21為對照菌株，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖2．由圖2可見，工程菌P6在11 ku處附近有特異條帶，而對照菌在該位置無條帶，電泳檢測結(jié)果與理論值基本相符，表明Pvfp6足絲蛋白已成功表達(dá)．

圖2 SDS-PAGE分析Pvfp6蛋白于BL21表達(dá)情況Fig.2 SDS-PAGE analysis of Pvfp6 protein expression in BL21

2.5 P6重組菌對Hg2+和Cd2+的抗性與富集

圖3給出P6重組菌與對照組30a在不同Hg2+質(zhì)量濃度下的生長曲線．由圖3可見，重組菌P6對Hg2+的最大抗性為5 mg/L，而對照組30a對Hg2+的最大抗性僅2 mg/L，且隨著Hg2+質(zhì)量濃度的升高，重組菌體進(jìn)入對數(shù)期的時(shí)間比對照組30a更短，表明P6經(jīng)表達(dá)足絲蛋白后抗汞能力有了一定程度的增強(qiáng)．

圖3 P6重組菌與對照組30a在不同Hg2+質(zhì)量濃度下的生長曲線Fig.3 Growth curves of P6 recombinant bacteria and control group 30a under different Hg2+ conditions

圖4給出了P6重組菌與對照組30a在不同Cd2+質(zhì)量濃度下的生長曲線．由圖4可見，重組對照菌pET-30a對Cd2+的最大抗性為120 mg/L，而P6重組菌對Cd2+的最大抗性為160 mg/L．P6重組菌對Cd2+的最大抗性高于對照組30a，說明P6重組菌表達(dá)的足絲蛋白確實(shí)具有鎘抗性．

從實(shí)驗(yàn)的抗性結(jié)果可見，重組菌相比對照菌株具有更強(qiáng)的抗重金屬能力，但要在含Hg2+的環(huán)境下生存和繁殖，需要一定的時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)和適應(yīng)．重金屬濃度越高，越容易出現(xiàn)生長遲滯的現(xiàn)象．隨著Hg2+和Cd2+質(zhì)量濃度的升高，最大生長菌量減少，究其原因可能是細(xì)菌在降解重金屬毒性物質(zhì)時(shí)，占用了大量的營養(yǎng)物質(zhì)和能量，影響細(xì)菌的生長．另外，P6重組菌表達(dá)的足絲蛋白富含大量的半胱氨酸和組氨酸殘基，能將進(jìn)入細(xì)胞中的非必需有毒金屬離子結(jié)合，減少細(xì)胞與有毒金屬的接觸，從而保護(hù)細(xì)胞免受金屬離子的毒性[16]．

圖4 P6重組菌與對照組30a在不同Cd2+質(zhì)量濃度下的生長曲線Fig.4 Growth curves of P6 recombinant bacteria and control group 30a under different Cd2+ conditions

對P6重組菌的Hg2+和Cd2+富集能力的實(shí)驗(yàn)研究表明，重組菌的重金屬的富集能力較宿主菌有一定的提高．重組菌對Hg2+的平衡富集量為109.89 mg/g，比對照組93.46 mg/g提高了17.58%；對Cd2+的平衡富集量為19.27 mg/g，比對照組16.50 mg/g提高了16.79%．在本研究中，如圖5所示，重組菌P6和對照菌30a在一定的Hg2+和Cd2+質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對重金屬離子的富集符合Langmuir吸附模型．隨著溶液中Hg2+和Cd2+質(zhì)量濃度的增加，菌體對重金屬離子的吸附量也增加，當(dāng)離子濃度達(dá)到一定量時(shí)，吸附達(dá)到平衡并趨于飽和狀態(tài)．總的來說，P6重組菌對Hg2+和Cd2+的富集量均高于對照組30a．富集量的增加可能是因?yàn)檫M(jìn)入胞內(nèi)的重金屬能被足絲蛋白中的半胱氨酸、組氨酸以及酪氨酸結(jié)合，從而表現(xiàn)為重組菌細(xì)胞對Hg2+和Cd2+的富集容量增加[17]．

圖5 P6重組菌與對照組30a的Hg2+和Cd2+的平衡富集量Fig.5 Equilibrium accumulation of P6 recombinant bacteria and control group 30a

結(jié) 語

本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序研究翡翠貽貝足絲蛋白，以及blast同源性搜索來自其他貽貝足絲蛋白的已知序列，結(jié)合現(xiàn)有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，以高通量方式快速預(yù)測和鑒定大量的蛋白質(zhì)序列，得到類翡翠貽貝足絲蛋白編碼序列．其中，pvfp6基因編碼的蛋白序列富含半胱氨酸和酪氨酸殘基的足絲蛋白，這可能是重金屬結(jié)合的關(guān)鍵因素，這些結(jié)論在實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)．該研究可為轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建提供資源支持，用于發(fā)現(xiàn)和識(shí)別其他重要的重金屬結(jié)合相關(guān)蛋白，以指導(dǎo)進(jìn)一步的重組蛋白質(zhì)工程和仿生材料處理，為海洋環(huán)境中重金屬污染的生物治理提供實(shí)驗(yàn)參考．