顧藝婧， 傅稼耀， 武文婧， 吳曉戀， 吳珺華

(同濟大學口腔醫(yī)學院口腔修復學教研室-上海牙組織修復與再生工程技術研究中心，上海 200072)

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis, OPM)是最常見的原發(fā)性骨質疏松癥[1]。目前臨床上大多采用雌激素替代療法或雙膦酸鹽類藥物治療[2]，但這些療法存在諸多并發(fā)癥[3]，如何有效安全地防治OPM，一直是國內外的研究熱點。近期研究表明，骨骼退變的機制復雜，其中細胞衰老發(fā)揮著重要作用[4]。衰老細胞分泌的以促炎細胞因子為主的衰老相關分泌表型(senescence associated secrete phenotype, SASP)，會影響自身及周圍正常細胞，導致組織功能障礙，從而損害器官。在骨組織中，衰老細胞分泌的SASP能促進破骨細胞形成，加重骨吸收；而靶向清除衰老細胞及SASP可有效抑制增齡性骨丟失[5]。最新研究證實，雌激素缺乏導致的骨質疏松也與細胞衰老有關[6]；且絕經或手術誘導絕經的女性在外周血中TNF-α、IL-1α等炎癥因子水平顯著提升，這些促炎細胞因子也被證明參與了OPM的發(fā)生[7-8]。這提示衰老細胞分泌的SASP很可能在OPM的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。槲皮素(quercetin, Q)是抗衰老藥的典型代表[9-10]，可有效清除衰老的人類內皮細胞和小鼠骨髓間充質干細胞[11]。那么，槲皮素能否通過清除衰老的骨相關細胞，抑制SASP分泌，從而防治OPM呢？為此，本研究擬建立骨相關細胞衰老體外模型及去勢小鼠骨質疏松癥動物模型，于體內外驗證槲皮素在OPM中對骨內細胞抗衰老的作用，從而為其臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

骨細胞樣細胞MLO-Y4由Lynda Bonewald博士提供。α-MEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)中添加5%胎牛血清(美國Gibco公司)、5%小牛血清(美國Gibco公司)、1%青霉素和鏈霉素(美國HyClone公司)，配制MLO-Y4細胞培養(yǎng)液。成骨細胞樣細胞MC3T3-E1購自中國科學院(上海)干細胞庫，α-MEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素，配制MC3T3-E1細胞培養(yǎng)液。在37℃，濕度95%和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)上述兩種細胞，每3d更換1次培養(yǎng)基。

1.2 體外細胞衰老模型建立

對貼壁良好的MLO-Y4及MC3T3-E1細胞分別使用含200和400μmol/L過氧化氫的培養(yǎng)液處理2h，移除培養(yǎng)液，PBS緩沖液清洗，10μmol/L過氧化氫對細胞進行二次刺激并持續(xù)培養(yǎng)48h，建立體外壓力誘導的成熟前衰老(stress-induced premature senescence, SIPS)模型。實驗分為3組： 對照(control)組、氧化應激壓力(OS)組和OS+槲皮素處理(OS+Q)組。給藥實驗中，相應濃度槲皮素(美國Sigma公司)與高濃度過氧化氫同期加入細胞培養(yǎng)液中，處理2h，移除培養(yǎng)液，洗滌細胞，再將藥物與低濃度過氧化氫同時加入細胞培養(yǎng)液中處理細胞48h。

1.3 體外槲皮素作用濃度篩選

采用細胞增殖活性試劑盒CCK-8(日本Dojindo公司)進行細胞活力分析。在96孔板中預培養(yǎng)24h后，正常組細胞加入0、5、10、20、30、50μmol/L梯度濃度的槲皮素孵育48h，按照說明書，用CCK-8溶液孵育，酶標儀450nm處測量光密度(D450)。OS組細胞于高濃度過氧化氫及梯度濃度槲皮素中處理2h后，移除培養(yǎng)液，再將低濃度過氧化氫及同等梯度濃度槲皮素加入孔板，培養(yǎng)2d后，用CCK-8溶液孵育，并測量光密度。梯度濃度的槲皮素處理正常細胞及過氧化氫刺激下的細胞后，分別獲得正常細胞藥物毒性曲線及氧化應激后的細胞藥物毒性曲線。

1.4 細胞衰老相關β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)

SA-β-gal染色(中國碧云天公司)遵循生產說明書進行。貼壁良好的MLO-Y4及MC3T3-E1細胞用PBS洗滌1次，室溫固定15min，PBS再蕩洗3次，每次不少于3min。加入配置好的半乳糖苷酶染色液，將細胞放置于干燥的37℃非CO2培養(yǎng)箱中避光過夜，次日洗滌后觀察染色情況并拍照。

1.5 實驗動物

7周齡雌性C57/BL6小鼠(購自上海斯萊克實驗動物公司)20只，平均體質量18g，在1周的適應期后，腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉(50mg/kg)。隨機抽取15只，按標準方法[14]行雙側卵巢切除術(OVX)，另5只行假手術(SHAM)。術后1周，開始給藥。其中，OVX小鼠再次隨機分為3組： 空載體(V)組(OVX+V組)、雌激素(E2)組(OVX+E2組)和槲皮素組(OVX+Q組)。OVX+V組和SHAM+V組采用10%PEG 400作為載體，每周經口等容灌胃給藥1次；雌激素組，按0.1mg/(kg·d)的劑量，每周經腹腔注射給藥3次；OVX+Q組每次50mg/kg，每周經口灌胃給藥1次。所有小鼠均處于標準無特異病原體級(SPF)實驗室環(huán)境，在整個實驗過程中，小鼠可隨意獲得標準飼料及水。給藥12周后，稱小鼠體質量。本實驗已通過同濟大學動物倫理審查(編號： TJLAC-018-029)，并嚴格按照倫理要求進行。

1.6 標本制備

術后13周，腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)，分離左股骨，置于4%多聚甲醛室溫下固定2d，后更換至0.5%多聚甲醛中，4℃條件下儲存，用于micro-CT掃描。分離右側股骨及脛骨用于提取RNA。

1.7 小鼠左股骨Micro-CT掃描

高分辨率顯微CT(瑞士Scanco Medical AG公司，μCT50型)掃描未經脫鈣的小鼠左股骨(每組3只)。在70kV，114μA，體素為14μm的條件下獲取股骨圖像，分析骨表面積與骨體積比值(BS/BV)、骨小梁分離度(Tb.Sp)和骨小梁數(shù)量(Tb.N)等骨參數(shù)來判定骨質疏松程度。

1.8 RNA提取及實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)

體內實驗中，利用分離的小鼠右側股骨和脛骨，仔細去除肌肉、軟組織及骨骺，用PBS沖洗骨髓腔3次確保無骨髓殘留。從富含骨細胞的骨皮質中提取小鼠骨細胞RNA。然后將骨標本置于TRIzol(日本TaKaRa公司)中溶解，并在液氮中徹底研磨，提取總RNA。體外實驗中，用預冷的PBS洗滌培養(yǎng)的細胞3次，加入TRIzol提取細胞總RNA。提取體內或體外細胞總RNA后，通過NanoDrop ND-2100(美國Thermo Scientific公司)定量。使用Agilent 2100生物分析儀(美國Agilent Technologies公司)評估RNA完整性。RNA懸液放入-80℃冰箱長期儲存，待使用時取出，于冰上解凍。使用PrimeScript?1stStrandcDNA合成試劑盒(日本TaKaRa公司)反轉錄mRNA，GAPDH作為內參。SYBR Green PCR master mix(瑞士Roche公司)用于qPCR擴增，加入各基因擴增引物，引物購自生物工程(上海)股份有限公司，并在LightCycler 96(瑞士Roche公司)上進行qPCR，使用LightCycler 96分析軟件(瑞士Roche公司)進行數(shù)據統(tǒng)計，從而得出體內外細胞SIPS、SASP及成骨破骨相關基因的表達水平。p21上游引物： 5′-CCTGGTGATGTCCGACCTG-3′；下游引物： 5′-CCATGAGCGCATCGCAATC-3′。p53上游引物： 5′-CTCTCCCCCGCAAAAGAAAAA-3′；下游引物： 5′-CGGAACATCTCGAAGCGTTTA-3′。IL-6上游引物： 5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3′；下游引物： 5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′。TNF-α上游引物： 5′-CCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3′；下游引物： 5′-GCTACGACGTGGGCTACAG-3′。IL-1α上游引物： 5′-GCACCTTACACCTACCAGA-GT-3′；下游引物： 5′-AAACTTCTGCCTGACGAGC-TT-3′。TRAP上游引物： 5′-CACCCTGAGATTTGT-GGCTGT-3′；下游引物： 5′-CGGTTCTGGCGATCT-CTTTG-3′。CTSK上游引物： 5′-GAAGAAGACTC-ACCAGAAGCAG-3′；下游引物： 5′-TCCAGGTTA-TGGGCAGAGATT-3′。OCN上游引物： 5′-CTGAC-CTCACAGATCCCAAGC-3′；下游引物： 5′-TGGTC-TGATAGCTCGTCACAAG-3′。RUNX2上游引物： 5′-AACGATCTGAGATTTGTGGGC-3′；下游引物： 5′-CCTGCGTGGGATTTCTTGGTT-3′。GAPDH上游引物： 5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′；下游引物： 5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

1.9 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據用GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用兩組獨立樣本t檢驗來驗證各組評價參數(shù)的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 槲皮素能有效抑制過氧化氫誘導的MLO-Y4和MC3T3-E1細胞的成熟前衰老

在槲皮素處理后，MLO-Y4和MC3T3-E1細胞的總體生存曲線均明顯抬高，10μmol/L槲皮素作用于MLO-Y4細胞，20μmol/L槲皮素作用于MC3T3-E1細胞，可有效阻止細胞進入衰老或清除SASP，有利于細胞增殖，見圖1。

過氧化氫處理MLO-Y4及MC3T3-E1細胞后可形成細胞衰老樣變化： SA-β-gal染色陽性率增加，見圖2A、B；細胞內SIPS通路的重要標志物p21、p53表達顯著上升，見圖2C、D；SASP表達水平顯著上升，見圖2E、F。在此基礎上，同期加入槲皮素可有效阻斷過氧化氫引發(fā)的兩種細胞的衰老，并且抑制SASP表達。

圖1 槲皮素對骨相關細胞的藥物毒性作用Fig.1 The cytotoxic effect of quercetin on bone cellsA: 骨細胞樣MLO-Y4細胞；B: 成骨細胞樣MC3T3-E1細胞；Control為正常細胞的藥物毒性曲線，OS為H2O2刺激氧化應激作用下的細胞藥物毒性曲線

圖2 槲皮素于體外抑制骨相關細胞的SIPS并清除SASPFig.2 Effects of quercetin on SIPS and SASP in bone cells in vitroA: 各組MLO-Y4細胞SA-β-gal染色；B: 各組MC3T3-E1細胞SA-β-gal染色；箭頭所指為典型陽性結果；C： 實時定量PCR檢測各組MLO-Y4細胞中衰老相關基因p21、p53的表達；D: 實時定量PCR檢測各組MC3T3-E1細胞中p21、p53表達；E: MLO-Y4細胞中衰老相關分泌表型TNF-α、IL-6的表達；F: MC3T3-E1細胞中TNF-α、IL-1α的表達；*P<0.05，**P<0.01

2.2 槲皮素有效挽救去勢小鼠骨丟失

術后13周，OVX+V組小鼠平均體質量增長值為(5.740±0.522)g，顯著高于SHAM+V組的(3.180±0.097)g，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而體質量變化在OVX+V組和OVX+E2組[(5.160±0.511) g]和OVX+Q組[(4.440±0.505) g]之間，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

與SHAM+V組相比，OVX+V組小鼠股骨的BS/BV、Tb.Sp顯著升高，Tb.N顯著降低，股骨的三維圖像也體現(xiàn)了兩組間骨松質的明顯差異，提示了骨質疏松的發(fā)生，證明去勢小鼠的骨質疏松模型已成功建立。在體內模型成功建立的基礎上，OVX+Q組小鼠股骨的BS/BV值、Tb.Sp值顯著降低，Tb.N值顯著升高，提示其可有效緩解OVX小鼠的骨質疏松，與傳統(tǒng)雌激素療法相比，差異無統(tǒng)計學意義。見圖3。

2.3 槲皮素在體內抑制去勢小鼠皮質骨內細胞衰老水平

術后13周，OVX+V組小鼠皮質骨內SIPS相關基因及SASP水平較SHAM+V組明顯上調，OVX+Q組SASP表達顯著降低，起到與雌激素相似的作用，見圖4。

圖3 槲皮素對去勢小鼠骨質疏松影響Fig.3 Effects of quercetin on osteoporosis of OVX miceA: μCT分析定量小鼠股骨骨表面積和骨體積比值(BS/BV，mm-1);B: 小鼠股骨骨小梁分離度(Tb.Sp，mm);C: 小鼠股骨骨小梁數(shù)量(Tb.N，mm-1);D: 小鼠股骨頭骨微結構的典型μCT圖像；*P<0.05

圖4 槲皮素對去勢小鼠骨相關細胞SIPS及SASP影響Fig.4 Effects of quercetin on SIPS and SASP in bone cells of OVX mice in vivoA: 實時定量PCR檢測各組小鼠骨皮質內SIPS相關基因的表達；B: 實時定量PCR檢測各組小鼠骨皮質內SASP相關基因的表達；*P<0.05，**P<0.01

2.4 槲皮素對去勢小鼠骨改建相關基因的影響

OVX+V組小鼠皮質骨內破骨、成骨相關基因表達顯著升高，OVX+E2組小鼠破骨、成骨相關基因表達均顯著下調。OVX+Q組小鼠皮質骨內破骨基因表達顯著下調，但成骨細胞相關基因不受抑制，見圖5。

圖5 去勢小鼠皮質骨骨改建相關基因的表達Fig.5 Expression of genes related to bone remodeling in OVX miceA: 實時定量PCR檢測各組小鼠骨皮質內破骨相關基因的表達；B: 實時定量PCR檢測各組小鼠骨皮質內成骨相關基因；*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

細胞衰老不論在老齡化骨丟失還是雌激素缺乏骨丟失中都起著重要作用[5,11]。通過抑制骨細胞衰老也可以預防雌激素缺乏骨質疏松[6]。細胞衰老主要分為復制性衰老(replicative senescence, RS)、SIPS和癌基因誘導的衰老(oncogene-induced senenscene, OIS)三種類型。目前，建立衰老細胞體外模型的方法主要是SIPS和OIS。OPM是由雌激素缺乏所引起的骨代謝失調，雌激素缺乏引發(fā)活性氧類(ROS)累積，ROS不僅在雌激素缺乏導致骨丟失的機制中起重要作用[12]，也是引發(fā)細胞DNA損傷，誘導SIPS[13]的因子之一。因此，在OPM的研究之中，ROS-SIPS較RS或OIS更適合用作細胞衰老研究的體外模型。ROS壓力源的種類多種多樣，包括過氧化氫處理[14]、電離輻射[15]、乙醇等。其中，過氧化氫處理是一種廣為認可的細胞衰老體外模型誘導源?，F(xiàn)階段大多數(shù)關于過氧化氫誘導的ROS-SIPS的研究模型主要聚焦于成纖維細胞[14]、脂肪細胞等細胞，卻鮮有關于骨相關細胞的體外模型。骨組織中，衰老的骨細胞分泌SASP[5]，從而影響骨組織質量，引起骨丟失。因此，本課題組選取了小鼠骨細胞樣細胞MLO-Y4和成骨細胞樣細胞MC3T3-E1進行研究。不同細胞株的細胞對過氧化氫的劑量反應不同。研究發(fā)現(xiàn)，200、400μmol/L過氧化氫分別是MLO-Y4及MC3T3-E1細胞最適宜的SIPS誘導濃度。另外，為了避免細胞只是進入短暫可逆的細胞周期阻滯，本研究對細胞進行二次低劑量過氧化氫刺激，從而使衰老水平穩(wěn)定表達。本研究證實了過氧化氫能夠誘導MLO-Y4和MC3T3-E1細胞產生衰老樣變化，使SIPS相關基因表達上調，SASP炎癥因子表達上升。

作為抗衰老藥物，槲皮素能夠有效清除衰老的骨髓間充質干細胞[5]，并且通過雌激素受體介導的通路促進骨髓間充質干細胞的增殖和成骨向分化，改善骨組織結構及功能[16-17]。由于在本研究中，槲皮素與過氧化氫同期加入細胞，可以認為槲皮素通過清除細胞環(huán)境內的SASP，阻斷細胞進入SIPS狀態(tài)，促進細胞增殖，從而形成細胞藥物毒性曲線上的抬高，與其他研究中所述靶向清除衰老細胞的作用不完全相同。體外實驗證實，槲皮素可以有效降低細胞SIPS水平，并阻斷SASP釋放。體內實驗顯示，槲皮素和雌激素都可抑制OVX小鼠皮質骨內SIPS水平，降低SASP表達，挽救OVX小鼠的骨丟失，提示細胞衰老可能在雌激素失調與骨丟失間起了關鍵作用，而槲皮素能緩解因雌激素缺乏導致的一系列變化。此外，破骨細胞相關基因的表達與SIPS相關基因及SASP表達趨勢相似，而成骨細胞相關基因的表達略有不同，槲皮素下調SIPS、SASP及破骨水平，但不抑制成骨相關基因的表達。這提示了破骨相關基因可能首先受SASP水平的影響，被促炎細胞因子激活，相應成骨相關基因也被激活。槲皮素通過清除SASP有效地下調破骨細胞相關基因，但并不影響已被激發(fā)的成骨作用，這提示槲皮素可能有助于骨重建和預防OVX小鼠骨質疏松癥?；诓灰种瞥晒沁@點，槲皮素似乎比雌激素更有優(yōu)勢，但還需要更多后續(xù)實驗驗證。

綜上所述，SIPS和雌激素相關骨丟失有密切關聯(lián)。早期應用槲皮素有助于抑制體外ROS-SIPS，并有效預防去勢小鼠發(fā)生雌激素缺乏性骨質疏松癥，抑制其骨內SASP表達，下調骨相關細胞細胞衰老水平。這表示抗衰老藥不僅僅是老齡化骨質疏松癥以及其他老齡性慢性疾病和功能障礙[18]的治療新方向，也為OPM的臨床治療提供了新的視角。