馬月花 郭曉瑞 楊 楠 張 野 唐中華 王洪政

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

鎘(Cd)是植物的非必需元素，也是毒性最強(qiáng)的重金屬污染物之一。目前，由于采礦、冶煉、垃圾焚燒以及含Cd肥料的過量使用，土壤環(huán)境面臨著巨大的Cd污染危機(jī)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國土壤中度和重度鎘污染點(diǎn)位超標(biāo)率為1%[2]。Cd對植物的毒害通常表現(xiàn)為根系和地上部生長受阻、水分和養(yǎng)分吸收受到抑制、生理代謝紊亂，并最終導(dǎo)致植物產(chǎn)量下降甚至引起植物死亡[3～4]。更為重要的是，鎘容易積累在植物中進(jìn)而通過食物鏈進(jìn)入人體，對人體健康造成巨大威脅[5]。

在面對Cd脅迫的過程中，植物也進(jìn)化出了多種應(yīng)對Cd脅迫的耐性機(jī)制。目前，國內(nèi)外學(xué)者一般都將植物對Cd毒害的耐性機(jī)制概括為兩類：避性機(jī)制和耐性機(jī)制[6～7]。避性機(jī)制主要是指植物通過根系以及根際微生物的分泌物等對周圍的Cd2+進(jìn)行螯合降低其毒性、或通過限制Cd2+的跨膜吸收減少進(jìn)入植物體內(nèi)Cd的數(shù)量[8～10]。耐性機(jī)制則是指植物體內(nèi)進(jìn)化出特定的機(jī)制來減緩進(jìn)入植物體內(nèi)的Cd對植物生長發(fā)育造成的危害，如Cd2+的區(qū)域化、將Cd2+螯合至無毒狀態(tài)、提高抗氧化活性避免引起次級傷害等[11～12]。一般來說，一種植物可能會具有不止一種的耐性機(jī)制，以提高其對Cd脅迫的抵抗能力。

黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bunge)是我國有名的傳統(tǒng)藥用植物，其干燥后的根莖中含有黃酮、皂苷和多糖等多種活性成分，具有補(bǔ)氣固表、利尿排膿、斂瘡生肌的功效[13]。雖然目前黃芪的主產(chǎn)區(qū)還未出現(xiàn)嚴(yán)重的土壤Cd超標(biāo)情況，但是隨著北方土壤中含Cd農(nóng)藥和化肥的過量使用以及工業(yè)排放的增加，黃芪主產(chǎn)區(qū)的土壤也已處在Cd污染的威脅之下。已有調(diào)查結(jié)果顯示，不同產(chǎn)區(qū)黃芪中藥材樣品中已出現(xiàn)不同程度的Cd超標(biāo)情況：山西29.41%、內(nèi)蒙古25%、黑龍江7.65%、甘肅13.16%[14]。因此，研究Cd對黃芪生長發(fā)育的影響并探討黃芪對Cd脅迫的耐性機(jī)制具有重要的理論和實(shí)踐意義。

本研究擬以黃芪幼苗為材料，在水培條件下研究不同程度Cd脅迫對其生長形態(tài)、礦質(zhì)元素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、次生代謝物質(zhì)合成等的影響，并研究黃芪對Cd的吸收和積累情況，以期在生理水平上探討得到黃芪對Cd的耐性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

膜莢黃芪(A.membranaceus(Fisch.) Bunge)種子購自河北省安國市元泰藥用植物種子站。黃芪皂苷Ⅰ-Ⅳ(Astragaloside Ⅰ-Ⅳ)、毛蕊異黃酮(Calycosin)、毛蕊異黃酮苷(Calycosin-7-O-β-D-glucoside)、刺芒柄花素(Formononetin)和刺芒柄花苷(Ononin)標(biāo)準(zhǔn)品均購自上海純優(yōu)生物科技有限公司。色譜級甲醇和乙腈購于北京百靈威化學(xué)有限公司；K、Ca、Mg、Fe、Cu、Zn、Mn、Cd的標(biāo)品購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心；去離子水(電阻率高于18.2 MΩ·cm-1)取自Milli-Q水純化系統(tǒng)(Millipore，USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃芪幼苗培養(yǎng)及Cd處理

黃芪種子用10%(v/v)次氯酸鈉浸泡2 min消毒并用自來水沖洗3 min后，在蒸餾水中吸脹12 h，然后播種于濕潤的蛭石中。待黃芪子葉出土并長至4～5 cm高時(shí)，選擇長勢一致的幼苗移栽至盛有Hoagland營養(yǎng)液(pH5.5)的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。所有培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)均在植物培養(yǎng)室中進(jìn)行，條件為：溫度為30℃/20℃(白天/黑夜)，白天時(shí)間為14 h，光照強(qiáng)度為400 μmol·m-2·s-1，相對濕度保持在60%～70%。水培3周后對黃芪幼苗進(jìn)行Cd處理，處理時(shí)培養(yǎng)液中加入CdCl2溶液并使其終濃度達(dá)到25、50、100、200 μmol·L-1。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包括10株幼苗。處理時(shí)間為7 d，期間每2 d更換處理液。處理結(jié)束后進(jìn)行各指標(biāo)的測定。

1.2.2 幼苗伸長抑制率及生物量測定

在處理前后用直尺(精度為1 mm)分別測定植株地上部的高度和根系長度，伸長生長抑制率計(jì)算如下：

(1)

處理結(jié)束后，將幼苗從根莖結(jié)合處分開，吸干表面水分后分別稱重(鮮重)，110℃殺青10 min后60℃烘干至恒重并稱重(干重)。

1.2.3 光合色素和丙二醛含量的測定

取黃芪幼苗植株頂端第二葉序的葉片，按照張憲政的方法[15]測定葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素的含量。

地上部和根系丙二醛含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法進(jìn)行測定[16]。

1.2.4 植物中金屬元素含量的測定

處理結(jié)束后，收獲黃芪幼苗根系和地上部，并將地上部分為頂部、中部和基部3個(gè)部分。用去離子水將各部分沖洗干凈后80℃烘干。將烘干樣品磨碎后，準(zhǔn)確稱取0.300 g放入消煮管中，并加入10 mL硝酸—高氯酸混合液(v/v=5∶1)進(jìn)行消煮。消煮結(jié)束后消煮管內(nèi)加入5 mL 2%(v/v)硝酸并溫浴后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用2%硝酸溶液進(jìn)行定容。

溶液樣品中金屬元素的含量使用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP-OES Optima 8000)進(jìn)行測定，其具體含量由各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。

1.2.5 次生代謝物質(zhì)含量的測定

取黃芪幼苗根部干樣0.50 g，加入80%乙醇10 mL超聲提取45 min(100 Hz，40℃)，過濾后將殘?jiān)儆?0 mL溶劑提取一次，合并兩次提取液。使用真空離心濃縮儀將提取液濃縮至干，用1 mL甲醇復(fù)溶樣品，14 000 r·min-1離心10 min，取上清液保存于-20℃冰箱中備用。

樣品中黃芪皂苷和類黃酮的含量使用超高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測定，具體色譜和質(zhì)譜條件等按照楊楠等的方法[17]進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

文中所列數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(19.0，IBM)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用SigmaPlot軟件(14.0，Systat Software)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd處理對黃芪幼苗生長的影響

Cd處理顯著抑制了黃芪幼苗根系和地上部的伸長生長，且根系對Cd處理的反應(yīng)更為敏感，因?yàn)榈厣喜吭?0 μmol·L-1Cd處理下才出現(xiàn)明顯的生長抑制，而根系在25 μmol·L-1濃度時(shí)即表現(xiàn)出明顯生長抑制。此外，根系和地上部生長抑制率均隨著Cd處理濃度增加顯著上升，但相同處理濃度下根系生長抑制率明顯高于地上部，經(jīng)擬合計(jì)算得知根系和地上部的IC50分別為62和248 μmol·L-1(圖1)。與伸長生長相同，在Cd處理下，特別是較高濃度Cd處理下，黃芪幼苗地上部和根系的鮮重及干重也明顯低于對照。

Cd處理引起了黃芪幼苗新生葉片明顯變黃，經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)第二葉序葉片中葉綠素a、b、總?cè)~綠素及類胡羅卜素的含量在較低濃度Cd下就比對照降低了50%左右(圖1)。雖然光合色素的含量隨著Cd濃度的升高有繼續(xù)降低的趨勢，但是不同處理濃度間的差異遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于Cd處理與對照之間的差異。除葉片變黃外，Cd處理還使得黃芪幼苗根系的顏色由白色變?yōu)榱俗厣?圖1)，說明處理后黃芪根系表皮細(xì)胞受到傷害。MDA含量測定的結(jié)果顯示，50 μmol·L-1Cd處理引起了黃芪幼苗根系MDA含量的明顯升高。Cd處理雖然也提高了黃芪幼苗地上部MDA的含量，但是其影響程度遠(yuǎn)低于根系。

2.2 黃芪幼苗生長對Cd的吸收和區(qū)域化

隨著Cd處理濃度的升高，地上部和根系的Cd含量逐步升高，并且其含量均與處理濃度之間呈現(xiàn)出良好的正相關(guān)關(guān)系。在不同濃度Cd處理下，黃芪幼苗根系的Cd含量始終遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于地上部，最高可達(dá)地上部的13倍(圖2)。從Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)(TF)結(jié)果來看，低Cd處理下黃芪幼苗Cd的TF值僅為0.055，雖然隨著Cd處理濃度的升高TF值也有所升高，但是在200 μmol·L-1Cd處理下TF值也僅為0.157。

除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)在所有Cd處理中地上部基部的Cd含量始終維持最高，中部Cd含量次之，而頂端Cd含量最低(圖2)。當(dāng)Cd處理濃度為200 μmol·L-1時(shí)，地上部基部Cd含量分別為中部和頂端的1.5和2.9倍。

2.3 Cd處理對黃芪幼苗礦質(zhì)元素吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

黃芪幼苗根系礦質(zhì)元素的吸收受到了Cd處理的嚴(yán)重影響(圖3)。Cd處理降低了根系中K、Ca、Zn、Mn的含量，特別是K，其含量在200 μmol·L-1Cd處理下比對照下降了46.2%。與上述4種元素的情況相反，根系中Mg、Fe和Cu的含量則受Cd處理的影響而增加，并且其增加程度隨著Cd處理濃度的升高而升高。

圖1 不同濃度Cd處理對黃芪幼苗生長的影響 所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了3次重復(fù)，誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)誤差。下同。Fig.1 Effect of different Cd treatments on the growth of A.membranaceus seedlings All experiments were performed in triplicate,and error bars represent SE.The same as below.

圖2 黃芪幼苗對Cd的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)Fig.2 The adsorption and translocation of Cd in A.membranaceus seedlings

圖3 Cd對黃芪幼苗礦質(zhì)營養(yǎng)元素吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 部位1～4依次為根系、地上部頂端、地上部中部和地上部基部。Fig.3 The effects of Cd treatments on adsorption and translocation of mineral elements in A.membranaceus seedlingsPartment 1-4 are root,upper shoot,middle shoot and basal shoot.

與根系不同，Cd處理下地上部頂端、中部和基部中幾乎所有礦質(zhì)營養(yǎng)元素的含量都明顯減少(圖3)。例外的是，隨著處理中Cd濃度的升高，地上部頂端的Ca含量以及基部的Mg含量出現(xiàn)了顯著的升高趨勢。200 μmol·L-1處理下，地上部頂端Ca的含量比對照升高了20%，基部Mg的含量則升高了38.1%。

2.4 Cd處理對黃芪幼苗次生代謝的影響

異黃酮和皂苷是黃芪中最受人關(guān)注的兩類次生代謝物質(zhì)，它們在根系中的含量受Cd處理影響發(fā)生了明顯變化(圖4)。與對照相比，較低濃度的Cd處理即引起了毛蕊異黃酮、刺芒柄花素以及毛蕊異黃酮苷和刺芒柄花苷含量的明顯升高。在50 μmol·L-1Cd處理下，4種異黃酮物質(zhì)的含量都達(dá)到最高值，其中毛蕊異黃酮達(dá)到了對照的7.2倍。隨著處理濃度的進(jìn)一步升高，異黃酮含量出現(xiàn)了較為明顯的下降趨勢。與異黃酮的反應(yīng)不同，Cd處理誘導(dǎo)了根系中黃芪皂苷Ⅰ-Ⅳ含量的顯著降低，并且黃芪皂苷含量下降的幅度受Cd濃度影響的程度遠(yuǎn)低于Cd處理本身。

圖4 Cd對黃芪幼苗根系次生代謝的影響Fig.4 The effects of Cd treatments on secondary metabolism in roots of A.membranaceus seedlings

3 討論

作為毒性最大的重金屬元素之一，Cd在較低濃度時(shí)就可以引起植物的中毒反應(yīng)，最為基本的可見癥狀為生長速率的降低以及隨之而來的葉片失綠等[18]。在本研究中，25 μmol·L-1Cd處理7 d后，黃芪幼苗根系伸長生長就受到了顯著抑制，隨著Cd處理濃度的升高，株高以及根系和地上部生物量積累也都明顯降低。此外，Cd處理還降低了黃芪幼苗新生葉片光合色素的含量，導(dǎo)致新生葉片失綠變黃。但是，即使在較高濃度Cd處理下，中下部葉片特別是基部老葉未發(fā)現(xiàn)失綠現(xiàn)象，暗示Cd處理主要抑制了葉綠素的合成而非促進(jìn)了原有葉綠素的降解。與本結(jié)果相一致，有報(bào)道認(rèn)為Cd引起葉綠素下降的原因可能是影響了葉綠素合成途徑的關(guān)鍵酶的活性[19]。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)Cd處理下地上部頂端Fe和Mg等與葉綠素合成和活性密切相關(guān)的元素含量明顯下降，這可能也是引起葉片變黃的因素之一。

Cd誘導(dǎo)的植物膜系統(tǒng)傷害及其透性增加是其重要的毒害機(jī)理之一[20]。我們發(fā)現(xiàn)，Cd處理引起了黃芪幼苗根系的褐變以及MDA含量的明顯增加，顯示Cd處理增加了根系質(zhì)膜的過氧化程度。隨著膜脂過氧化程度的加劇，多種位于膜上的重要酶的空間結(jié)構(gòu)也隨之遭到破壞，并最終引起膜的空隙和透性增大[21]。干擾植物對礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)也是造成Cd毒害的原因之一[22]，本研究中Cd處理顯著降低了黃芪根系中K、Ca、Zn、Mn以及地上部幾乎全部種類元素的含量。Cd毒害引起的根系細(xì)胞膜系統(tǒng)透性增加導(dǎo)致小分子物質(zhì)外流，削弱了植物細(xì)胞主動(dòng)吸收礦質(zhì)元素的作用[25]是其擾亂營養(yǎng)元素吸收的重要機(jī)理之一。其它機(jī)理則包括Cd2+與礦質(zhì)營養(yǎng)元素競爭根系質(zhì)外體陽離子吸收位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白結(jié)合位點(diǎn)等[23～24]。

黃芪幼苗在實(shí)驗(yàn)濃度Cd處理下顯現(xiàn)出的受害現(xiàn)象說明其對Cd脅迫的耐受性遠(yuǎn)低于十字花科的多種Cd超量積累植物，但是當(dāng)與其近緣物種苜蓿相比時(shí)，它又表現(xiàn)出較高的Cd耐性[26]。限制植物體對Cd的吸收或?qū)⑦M(jìn)入植物體的Cd區(qū)域化地積累在液泡或代謝活性不旺盛的老舊組織中是植物提高其Cd耐性的重要機(jī)制[20,27]。在黃芪幼苗中，黃芪吸收的Cd主要積累在根部，向地上部運(yùn)輸?shù)哪芰艿?，其TF值最高僅為0.157。此外，黃芪地上部老葉中Cd的含量最高，而新生組織中含量最低。以上結(jié)果說明黃芪通過調(diào)控Cd的空間分布，最大限度地保護(hù)了地上部新生組織，以提高其在Cd處理下存活的能力。

Ca是植物的必需元素，它與Cd具有強(qiáng)烈的位點(diǎn)競爭效應(yīng)并在維持膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面具有重要作用[28]。Cd處理降低了黃芪幼苗根系以及地上部中下部位的Ca含量，卻提高了地上部頂端的Ca含量，推測此反應(yīng)可能在保護(hù)黃芪地上部新生組織免受更大的Cd2+傷害方面具有積極作用。此外，在植物中Mg2+和Cd2+之間具有很強(qiáng)的拮抗作用，Mg營養(yǎng)的缺乏會大大提高Cd對植物組織的毒害水平[29]。我們發(fā)現(xiàn)，Cd處理下Mg在黃芪地上部的基部發(fā)生了特異性的積累上升，這與Cd在地上部的主要積累部位相一致，我們猜測在老葉中高含量的Mg通過與Cd的拮抗作用一定程度上降低了Cd對老葉的毒害作用，最大限度地維持老葉的基本生理功能。

異黃酮和黃芪皂苷類物質(zhì)是黃芪藥用中最主要的兩類次生代謝活性物質(zhì)。研究資料顯示，豆科植物細(xì)胞在面對不同環(huán)境刺激時(shí)會選擇性地大量積累異黃酮或皂苷類物質(zhì)，并在其防御反應(yīng)中起著重要作用[30]。在我們的研究結(jié)果中，黃芪面對Cd脅迫時(shí)根系中積累了大量的異黃酮類物質(zhì)，而黃芪皂苷含量則明顯下降，表明黃芪選擇了增加異黃酮而非皂苷類物質(zhì)的合成來應(yīng)對所面臨的Cd脅迫。同時(shí)，異黃酮類化合物自身還具有有較高的抗氧化活性[31]，所以Cd處理下異黃酮的增加還可能在降低Cd引起的氧化脅迫中發(fā)揮了積極作用。

綜上所述，Cd脅迫可以通過抑制黃芪幼苗根系和地上部生長、阻礙光合色素合成、破壞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性以及干擾礦質(zhì)營養(yǎng)成分吸收和平衡影響黃芪幼苗的生長發(fā)育，而黃芪幼苗則通過將進(jìn)入體內(nèi)的Cd進(jìn)行區(qū)域化、調(diào)控拮抗性礦質(zhì)元素定向累積、提高異黃酮物質(zhì)產(chǎn)量等途徑積極響應(yīng)Cd脅迫，以降低其毒害水平。