鄧贛奇 劉燊 冷桂華

摘要 [目的]研究亞香棒蟲草多糖C-10體外抗腫瘤活性。[方法]以亞香棒蟲草分離篩選的內(nèi)生真菌為菌種，液體轉(zhuǎn)化發(fā)酵產(chǎn)蟲草多糖，經(jīng)過分離提取得胞內(nèi)和胞外多糖，并探討其對3株癌細胞（肺腺癌A549細胞、乳腺癌MCF-7細胞、神經(jīng)母癌SH-SY5Y細胞）的生長抑制效果。[結(jié)果]隨著時間和濃度的增大，胞內(nèi)多糖對癌細胞的抑制率逐漸增大，且差異較為明顯，在培養(yǎng)72 h的條件下，BN-H多糖（0.096 6 mg/mL）對肺腺癌A549細胞、乳腺癌MCF-7細胞、神經(jīng)母癌SH-SY5Y細胞的抑制率分別為97%、71%、97%，比其他濃度的胞內(nèi)外多糖抑制效果更好。[結(jié)論]BN-H（0.096 6 ?mg/mL）的亞香棒蟲草多糖對肺腺癌、乳腺癌和神經(jīng)母癌細胞具有極顯著抑制作用（P<0.01），具有較強的時間和濃度依賴性，且胞內(nèi)多糖對癌細胞的抑制效果好于胞外多糖。

關(guān)鍵詞 亞香棒蟲草;蟲草多糖;癌細胞;MTT法;抗腫瘤活性;抑制率

中圖分類號 S 567.3+5 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）12-0187-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.051

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract [Objective] The research aimed to ?study the antitumor activity of Cordyceps hawkesii polysaccharide C10 in vitro.[Method]The endophytic fungi isolated from Cordyceps hawkesii were used as strains to produce cordyceps polysaccharides by liquid transformation.The intracellular and extracellular polysaccharides were isolated and extracted，and the inhibitory effects on the growth of three cancer cells （A549 cells，breast cancer MCF7 cells and neuroblastoma cancer SHSY5Y cells） were investigated.[Result]With the increase of time and concentration，the inhibition rate of intracellular polysaccharides on cancer cells was gradually increased，and the difference was obvious.Under the condition of raising 72h，the inhibitory rates of cancer A549 cells，breast cancer MCF7 cells and neuroblastoma cancer SHSY5Y cells were 97%，71% and 97% respectively，which were better than those of other concentrations of extracellular polysaccharides.[Conclusion]The polysaccharide of BNH （0.096 6 ?mg/mL） can inhibit lung adenocarcinoma，breast cancer and neuroblastoma significantly （P<0.01），and has a strong time and concentration dependent effect on lung adenocarcinoma，breast cancer and neuroblastoma （P<0.01）.The inhibitory effect of intracellular polysaccharides on cancer cells was better than that on extracellular polysaccharides.

Key words Cordyceps hawkesii;Cordyceps polysaccharide;Cancer cell;MTT method;Antitumor activity;Inhibition rate

蟲草主要由兩部分構(gòu)成，即千尸毛“蟲”和頭部長出來的真菌“草”，它的各種活性成分物質(zhì)具有降壓[1]、舒張血管[2]、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能[3]、抗腫瘤[4]、抗菌[5]、抗氧化[6]等功效[7]。冬蟲夏草被稱為我國的“中藥之王”，位列三大補品之首，研究發(fā)現(xiàn)，在中國境內(nèi)有100多種蟲草，只有一種叫做冬蟲夏草，足見其稀缺珍貴[8]。亞香棒蟲草（Cordyceps hawkesii Gray.） 又稱霍克斯蟲草，蟲體外面灰黃色，“草部”呈淡灰色至灰黑色。亞香棒蟲草比較脆而且容易折斷，氣微香，味淡，其主要靠寄生鱗翅目蝙蝠蛾科棒蝠蛾屬（Napialus）幼蟲來生長[9]。在成分和功能作用上與冬蟲夏草十分接近，因此有些地方直接用亞香棒蟲草代替冬蟲夏草食用，具有止咳、化痰、定喘、安神、益精氣及益腎壯陽等功效[10]。

蟲草多糖是亞香棒蟲草中含量最高的活性物質(zhì)，它是一類高分子化合物，構(gòu)造復雜，且擁有廣泛的藥理作用，引發(fā)越來越多的研究學者關(guān)注。蟲草多糖是國際醫(yī)學上公認的人體免疫增強劑，作用效果良好，可以調(diào)節(jié)機體的免疫功能，增強體液免疫和細胞免疫，從而提高機體的免疫力[11]。而隨著天然產(chǎn)物分離純化技術(shù)、細胞生物學、藥效學和藥理學的發(fā)展，天然產(chǎn)物抗腫瘤的研究正成為一個越來越熱門的研究領(lǐng)域，因為它相比于化療來治療癌癥的副作用小，比較被人們接受，一旦研究人員能夠發(fā)明出一種天然活性產(chǎn)物制劑來治療癌癥，那對于世界的貢獻不亞于工業(yè)革命或者計算機信息技術(shù)革命[12]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究也表明，蟲草多糖溶液對S180腫瘤細胞[13]、Lewis肺癌[14]、乳腺癌有明顯的抑制作用[15]。也有報道稱真菌多糖對肝癌SMMC-7721、肺腺癌A549[16]、人宮頸癌Hela[17]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251、回盲腸癌HCT-8這些細胞的增殖都有明顯的抑制作用，而這都表明蟲草多糖將成為治療癌癥的重要研究對象，以此來達到治療某些癌癥的目的。筆者主要探究亞香棒蟲草多糖提取過程及對體外癌細胞增殖的影響，為以后研究用蟲草多糖來治療癌癥提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌種。亞香棒蟲草真菌（實驗室培養(yǎng)并篩選得來）;MCF-7（乳腺癌細胞）、SH-SY5Y（神經(jīng)母癌細胞）、A549（肺腺癌細胞）細胞株均購于上海細胞生物學研究所細胞庫。

1.1.2 試驗試劑與樣品。

0.2%胰蛋白酶液，牛胎血清，5 mg/mL MTT溶液，DMSO溶液，胎盤藍，葡萄糖，酵母粉，土豆，蛋白胨，硝酸銨（NH4NO3），硫酸鎂（MgSO4），磷酸二氫鉀（KH2PO4），磷酸氫二鉀（K2HPO4），硫酸亞鐵（FeSO4），維生素B1，甘氨酸，抗生素，DMEM培養(yǎng)液，PBS緩沖液（pH 7.4）。

1.1.3 試驗設備。HH.CP-T型CO2培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）;超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）; LX-B35L立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫(yī)療設備有限公司）;ZW-A微量振蕩器（常州國華電器有限公司）;XDS-1B倒置生物顯微鏡（重慶光電有限公司）;微量移液槍（Eppendorf艾本德）;TGL-16W高速低溫離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）;BCD-211BSA海爾冰箱（青島海爾股份有限公司）;AIRTECH雙人單面超凈工作臺（深圳市杉本貿(mào)易有限公司）;SPX-250BS-II生化培養(yǎng)箱（西安明克斯檢測設備有限公司）;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）;TDL-40B飛鴿牌系列離心機（上海安亭科學儀器廠）;酶標儀（江西華科精密儀器有限公司）;液氮罐（南昌江竹實業(yè)有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 多糖提取工藝流程。胞內(nèi)多糖的提取工藝：保存的菌種→菌種活化→擴大培養(yǎng)→發(fā)酵培養(yǎng)→醇洗（2～5 mL）→ 抽濾→菌絲體→烘干（50 ?℃）剪碎→液氮研磨（研成60目，倒入廣口瓶中）→ 加15 ?mL 85%乙醇超聲30 min ?→離心得上清液（胞內(nèi)粗多糖） →胞內(nèi)粗多糖的提純。胞外多糖的提取工藝：保存的菌種→菌種活化→擴大培養(yǎng)→發(fā)酵培養(yǎng)→抽濾→發(fā)酵液（胞外粗多糖）→胞外粗多糖的提純。

1.2.2 多糖提取的操作要點。

1.2.2.1 菌種活化及擴大培養(yǎng)。

將保存在冰箱中的亞香棒子座白絲菌種接種到土豆培養(yǎng)基平板上，放入到25 ℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d，完成菌種的活化。將活化后的真菌接種到土豆液體培養(yǎng)基中，放入搖床中，在25 ℃、150 ?r/min的條件下，振蕩培養(yǎng)5 d。

1.2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)。

以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米粉作為碳源，蛋白胨、硝酸銨、豆粕作為氮源發(fā)酵，按10%菌種量進行接種，接完種后，分2種培養(yǎng)條件進行發(fā)酵，產(chǎn)胞內(nèi)多糖的條件為pH 5.5、培養(yǎng)溫度22 ℃、光照和搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，產(chǎn)胞外多糖的條件為pH 6.5、培養(yǎng)溫度22 ℃、前3 d光照后4 d 避光和不搖瓶。

1.2.2.3 多糖提取。

培養(yǎng)時間到后，對其進行抽濾，抽濾得到的發(fā)酵液含有胞外粗多糖，抽濾得到的菌絲體含有胞內(nèi)粗多糖。將菌絲體放入鼓風干燥箱中烘6～7 h，此時菌絲體完全干燥。再將完全干燥的菌絲體進行液氮研磨，菌絲體研磨成60目細度左右即可。將研碎的粉末倒入廣口瓶中，加15 mL 85%乙醇，并放入超聲波中超聲浸提30 min;浸提完后，在4 000 r/min、15 min的條件下，用離心機離心得上清液，即得胞內(nèi)粗多糖。

1.2.2.4 多糖的提純。

將離心得到的上清液置于廣口瓶中，加入3～4倍上清液體積的85%乙醇，沉淀1 d，過濾得胞內(nèi)粗固體多糖，用乙醚清洗固體，過濾，得到除去脂肪和蛋白質(zhì)的胞內(nèi)粗固體多糖，保存冰箱備用，胞外粗多糖的提純同理可得。

1.2.3 多糖抗腫瘤活性的操作步驟。

1.2.3.1 MTT法原理。

活細胞中的琥珀酸脫氫酶能使噻唑蘭（MTT）還原為藍紫色結(jié)晶甲臜并沉積在細胞中，死細胞不能利用此功能，DMSO（二甲基亞砜）能將沉積在細胞中的甲臜溶解，用酶標儀在490 nm波長下測定其吸光值，從而可得其生長率，進一步得多糖對癌細胞的抑制率[18]。

1.2.3.2 胞內(nèi)多糖對乳腺癌細胞（MCF-7）、神經(jīng)母癌細胞（SH-SY5Y）和肺腺癌細胞（A549）增殖抑制作用的主要操作要點。

取傳代2～3 d的乳腺癌MCF-7細胞、神經(jīng)母癌SH-SY5Y細胞和肺腺癌A549細胞，用1 mL 0.2%胰蛋白酶消化細胞，消化時間為1～3 min，加入2 mL的PBS緩沖液進行稀釋，用移液槍輕輕對其進行反復吹打，混合均勻，制成單細胞懸液;在1 000 r/min、3 min的條件下放入離心機中進行離心，待離心完畢后，吸去上清液，加3～4 mL的細胞培養(yǎng)基，再用移液槍輕輕對其進行吹打，混合均勻。

取少量細胞液，用臺盼藍對其進行染色，染色后進行計數(shù)，并計算濃度，計算結(jié)果為5萬/mL，稀釋10倍;然后進行種板，以每孔5 000個細胞種于96孔板中，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。

培養(yǎng)1 d后，設置試驗組 Ⅰ （BN-H、BN-M、BN-L）、試驗組 Ⅱ （BW-H、BW-M、BW-L）和陰性對照組、空白對照組8組試驗，每個試驗組設置3個復孔，再取其平均值，試驗組 Ⅰ 加入胞內(nèi)多糖：BN-H（0.096 6 mg/mL）、BN-M（0.048 3 mg/mL）、BN-L（0.024 mg/mL），試驗組二加入胞外多糖：BW-L（0.054 mg/mL）、BW-M（0.216 mg/mL）、BW-H（0.865 mg/mL）;空白組只加入培養(yǎng)液，對照組則只加癌細胞和培養(yǎng)液。加完之后，放入CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48和72 h。

培育完后，每孔中加入10 μL 5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，吸掉洗液，加150 μL DMSO，振蕩3～5 min，在490 nm波長的條件下，用酶標儀測其OD值，按公式計算其抑制率。 存活率=（試驗組-空白組）/（對照組-空白組）×100%; 抑制率= 1-存活率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 用酶標儀測出OD值，根據(jù)計算公式算出蟲草多糖對肺腺癌A549、乳腺癌MCF-7、神經(jīng)母癌SH-SY5Y細胞的存活率，算出抑制率，用軟件SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲草多糖對肺腺癌A549細胞的抑制效果

由表1可知，BN-H、BN-M、BN-L的胞內(nèi)多糖和BW-H的胞外多糖對肺腺癌細胞有顯著抑制作用（P<0.05），BW-L和BW-M的胞外多糖對肺腺癌A549細胞沒有顯著抑制作用（P>0.10）。由圖1可得，蟲草多糖隨著培養(yǎng)時間的延伸其抑制效果都顯著增強，但BW-L和BW-M的胞外多糖對肺腺癌A549細胞的抑制效果較差，在培養(yǎng)時間達到72 h時，抑制率仍沒有超過20%。而BN-H、BN-M的胞內(nèi)多糖在培養(yǎng)到72 h時，對肺腺癌A549細胞的抑制率分別達88%、97%，效果較好。其中，BW-H的胞外多糖對肺腺癌A549的抑制效果達到最佳，且胞內(nèi)多糖的抑制效果整體比胞外多糖好。

2.2 蟲草多糖對乳腺癌MCF-7細胞的抑制效果

由表2可知，除BW-L的胞外多糖對乳腺癌MCF-7沒有顯著性抑制作用外，其余的都具有顯著性抑制作用。由圖2可知，BN-L、BN-M和BN-H的胞內(nèi)多糖對乳腺癌MCF-7的抑制率隨著時間的增大而增大，當培養(yǎng)時間超過48 h時，抑制率的增速比48 h前的增速快。當培養(yǎng)到72 h時，BN-L、BN-M和BN-H胞內(nèi)多糖的抑制率分別為35%、48%、71%，效果較好。BW-L和BW-M的胞外多糖對乳腺癌MCF-7的抑制作用較弱，培養(yǎng)到72 h時，抑制率分別為23%、32%，說明這2個濃度的胞外多糖對乳腺癌MCF-7細胞的抑制效果不是很好。

2.3 蟲草多糖對神經(jīng)母癌SH-SY5Y細胞的抑制效果

由表3可知，BN-M、BN-H的胞內(nèi)多糖和BW-H、BW-M和BW-L 的胞外多糖對神經(jīng)母癌SH-SY5Y細胞具有顯著抑制作用，但BN-L的胞內(nèi)多糖不具有顯著性抑制作用。由圖3可知，在培養(yǎng)時間48 h以前，BW-L和BW-M的胞外多糖對神經(jīng)母癌SH-SY5Y細胞抑制作用非常微弱，甚至可能對神經(jīng)母癌SH-SY5Y細胞的增殖具有促進作用。BN-H和BN-M的胞內(nèi)多糖對神經(jīng)母癌SH-SY5Y細胞的抑制效果比BN-L明顯更好，隨著培養(yǎng)時間的延長，其抑制率都顯著增大，當培養(yǎng)時間到72 h時，BN-H的胞內(nèi)多糖抑制率為97%，效果較好，但表現(xiàn)出較強的時間依賴性。

3 結(jié)論

蟲草多糖對肺腺癌A549細胞、乳腺癌MCF-7細胞、神經(jīng)母癌SH-SY5Y細胞抑制作用與蟲草多糖的濃度和作用時間關(guān)系密切。

濃度方面，蟲草多糖對肺腺癌A549細胞、乳腺癌MCF-7細胞、神經(jīng)母癌SH-SY5Y細胞都具有一定的抑制作用，其中BN-H和BN-M的胞內(nèi)多糖對這3種癌細胞的抑制作用較為顯著，濃度低的胞內(nèi)多糖抑制效果不那么明顯，甚至對癌細胞具有增殖作用，也表明蟲草多糖對癌細胞的抑制作用具有濃度依賴性，且濃度更小的BN-H（0.096 6 mg/mL）胞內(nèi)多糖比濃度更大的BW-H胞外多糖（0.865 mg/mL）抑制效果更好，胞內(nèi)多糖的抑制效果也整體好于胞外多糖。

時間方面，蟲草多糖隨著培養(yǎng)時間的延長，對肺腺癌A549細胞、乳腺癌MCF-7細胞、神經(jīng)母癌SH-SY5Y細胞的抑制效果增強，也具有較強的時間依懶性。

通過以上試驗分析得出，亞香棒蟲草多糖C-10在適宜的濃度時呈現(xiàn)出較為顯著的抗腫瘤作用。

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