陳蘭 朱晨 李小楨

摘要 茶樹遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是指應(yīng)用重組DNA技術(shù)、細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)或種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化技術(shù)，有目的地將外源基因或DNA片段插入到茶樹受體基因組中并使其在后代植株中得以表達(dá)的過程，在茶樹遺傳改良、品種選育中發(fā)揮重要作用。對(duì)茶樹遺傳轉(zhuǎn)化中受體系統(tǒng)建立、茶樹遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行概述，闡述了茶樹遺傳轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)、方向以及當(dāng)前茶樹遺傳轉(zhuǎn)化研究所面臨的轉(zhuǎn)化效率低和離體再生困難的問題，提出了原位轉(zhuǎn)化技術(shù)在茶樹遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用潛力，從而達(dá)到優(yōu)化茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系的目的。

關(guān)鍵詞 遺傳轉(zhuǎn)化;外植體;農(nóng)桿菌介導(dǎo)法;基因槍法

中圖分類號(hào) S 571.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）12-0014-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.004

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract Genetic transformation technology of Camellia sinensis refers to the process of using recombinant DNA technology，cell tissue culture technology or germplasm system transformation technology to purposely insert a foreign gene or DNA fragment into the recipient genome of Camellia sinensis and express it in the progeny plants.It played an important role in genetic improvement and variety selection of Camellia sinensis.We reviewed the system of receptor regeneration and genetic transformation of Camellia sinensis in vitro，and recent advance in genetic transformation of Camellia sinensis were discussed.And also revealed the problems of low transformation efficiency and difficulty in vitro regeneration of the current genetic transformation research institute of Camellia sinensis.Consequently，planta agrobacterium mediated was proposed to achieve the purpose of optimizing the genetic transformation system of Camellia sinensis.

Key words Genetic transformation;Explant;Agrobacterium mediated;Bombardment mediated

植物遺傳轉(zhuǎn)化是指應(yīng)用重組DNA技術(shù)、細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)或種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化技術(shù)，有目的地將外源基因或DNA片段插入到受體植物基因組中，并使其在后代植株中得以表達(dá)的過程。植物遺傳轉(zhuǎn)化體系包括3個(gè)方面：植物遺傳轉(zhuǎn)化的受體體系、植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法以及轉(zhuǎn)基因植株再生和檢測(cè)。從20世紀(jì)70年代起，植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)不斷發(fā)展，特定基因能夠根據(jù)人們的意愿在植物上得以表達(dá)。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)打破了常規(guī)育種的界限，為改良作物、創(chuàng)造新品種的基因工程提供了一條新的途徑，并對(duì)提高農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益提供新的思路[1]。

茶樹[Camellia sinensis （L.） O.Kuntze]屬多年生異花授粉的木本植物，目前茶樹育種的主要方法仍是常規(guī)系統(tǒng)育種和雜交育種[2]。但茶樹的生育周期長(zhǎng)、自交不親和以及人工授粉成功率低等特性給育種工作帶來很大限制[3]。作為我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，茶樹基因改良日益受到重視[4-5]。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)既能縮短優(yōu)良品種的選育周期形成茶樹的定向育種，又能實(shí)現(xiàn)對(duì)茶樹抗逆性狀的篩選[6]。通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將目標(biāo)基因?qū)氩铇渲?，培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗逆性強(qiáng)的茶樹品種，使茶樹品種按生產(chǎn)和市場(chǎng)的需求方向培育，從而推動(dòng)茶葉經(jīng)濟(jì)的發(fā)展[7]。

1 茶樹受體系統(tǒng)的建立

建立良好的受體系統(tǒng)是茶樹遺傳轉(zhuǎn)化的重要基礎(chǔ)。茶樹受體系統(tǒng)的建立包括外植體的選擇及外植體的消毒、培養(yǎng)基的選擇、植物激素和外源添加物的選擇、外植體褐化和調(diào)控等影響因素。

1.1 外植體的選擇 選擇適宜的外植體是受體系統(tǒng)建立的關(guān)鍵，茶樹外植體常見的培養(yǎng)方式有器官培養(yǎng)和愈傷組織培養(yǎng)，此外茶樹品種、外植體的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)外植體的選擇也有一定的影響。

茶樹的子葉和莖段在器官培養(yǎng)中再生能力優(yōu)于茶樹其它器官。茶樹子葉多用于誘導(dǎo)體胚，Mondal等[8]以子葉誘導(dǎo)的體胚作為轉(zhuǎn)化受體，首次獲得茶樹的轉(zhuǎn)基因植株;Saini等[9]和Lv等[10]相繼用子葉誘導(dǎo)體胚進(jìn)行茶樹遺傳轉(zhuǎn)化，也獲得了轉(zhuǎn)基因植株。利用茶樹子葉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化成功率較高，但也存在缺點(diǎn)，表現(xiàn)為部分優(yōu)良的茶樹品種不易產(chǎn)生種子，或子葉是雜合體，遺傳背景與母體之間存在較大差異;子葉的離體培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化需要較長(zhǎng)時(shí)間，Mondal等[8]建立的轉(zhuǎn)化體系至少需要490 d。為了保持優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定的遺傳背景，Sandal等[11]認(rèn)為茶樹遺傳轉(zhuǎn)化的受體采用茶樹葉片優(yōu)于子葉，但茶樹葉片的離體成活率僅0～7.1%[12]。而茶樹莖段在茶樹遺傳轉(zhuǎn)化具有很大的潛力，在茶樹莖段培養(yǎng)中，要選擇有一定成熟度、富含營(yíng)養(yǎng)成分的莖段，有研究表明取第二腋芽的莖段為外植體，萌芽率最高[13]。

茶樹愈傷組織也是遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用較多的受體材料，不同外植體所需誘導(dǎo)愈傷組織的時(shí)間不同，花藥誘導(dǎo)愈傷組織的時(shí)間為7～l0 d，子葉和根需要8～12 d，莖段需要9～12 d，而葉片需要20 d[14]。當(dāng)外植體的切口處脫分化形成淺黃色致密的愈傷組織塊，就可進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茶樹遺傳轉(zhuǎn)化，駱穎穎等[15]以茶樹葉片及莖段形成的愈傷組織為受體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，成功獲得了GUS瞬時(shí)表達(dá)。但茶樹愈傷組織在遺傳轉(zhuǎn)化中多運(yùn)用于瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證，利用愈傷組織實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株尚未報(bào)道。

在選擇外植體時(shí)也要考慮到茶樹品種，茶樹基因型對(duì)器官分化及愈傷組織產(chǎn)生起關(guān)鍵作用。不同茶樹品種的生理代謝和信號(hào)傳遞等基因存在差異，導(dǎo)致茶樹的誘導(dǎo)率和啟動(dòng)率不同[16]。陳振光等[17]采用福云7號(hào)等9個(gè)茶樹品種進(jìn)行花藥培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)僅福云7號(hào)可誘導(dǎo)出植株。袁弟順等[18]表明在培養(yǎng)條件一致的情況下，不同茶樹品種的愈傷組織生長(zhǎng)量不同，由大到小依次為福鼎大白茶、福云595、福安大白、福鼎大毫、福云6號(hào)。駱穎穎等[15]對(duì)龍井長(zhǎng)葉等9個(gè)不同茶樹品種的葉片進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅龍井長(zhǎng)葉和浙農(nóng)23這2個(gè)茶樹品種分別在不同的菌系侵染中得到GUS瞬時(shí)表達(dá)。此外外植體的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)茶樹遺傳轉(zhuǎn)化有重要影響，采用幼嫩的外植體較適宜，同時(shí)也要考慮外植體的恢復(fù)再生水平，張廣輝等[2]表明茶樹發(fā)根誘導(dǎo)的最適苗齡為70 d，苗齡因素對(duì)葉片發(fā)根的影響最大。

1.2 影響茶樹受體系統(tǒng)建立的因素

1.2.1 外植體的消毒。在確保外植體取材適宜后，消毒是茶樹受體系統(tǒng)建立的首要步驟，外植體有效消毒后才能實(shí)現(xiàn)后期正常生長(zhǎng)及分化。依據(jù)茶樹外植體選取的不同，消毒的方式也不同，對(duì)茶樹子葉消毒多采用4% 次氯酸鈣、0.1% 氯化汞、吐溫80和75% 乙醇等，及無菌水的多次沖洗[8-9];對(duì)茶樹莖段消毒多采用70%乙醇、0.1%氯化汞等，及無菌水的多次沖洗[6，12-13]。外植體消毒后，有效降低了污染率，接種在培養(yǎng)基上，進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)工作。

1.2.2 培養(yǎng)基的選擇。茶樹離體培養(yǎng)中多采用Murashige and Skoog（MS）培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基滿足茶樹離體培養(yǎng)所需要的無機(jī)鹽和微量元素。楊國(guó)偉等[19]在誘導(dǎo)茶樹愈傷組織時(shí)選用無機(jī)鹽含量高、微量元素全的MS培養(yǎng)基、無機(jī)鹽中等的Heller培養(yǎng)基和無機(jī)鹽含量較低的White培養(yǎng)基進(jìn)行比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織含量最高，達(dá)90%。張婭婷等[20]利用MS 、N6（Chus N-6）和White 為基本培養(yǎng)基，附加相同量的維生素、氨基酸、糖及植物激素等來培育藪北茶芽苗，結(jié)果仍是MS培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率較優(yōu)。有研究表明將MS培養(yǎng)基的大量元素減半，利于茶樹莖段的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)，也可減少莖段褐化，提高成活率[21]。但在茶樹離體培養(yǎng)中培養(yǎng)基的選擇并非限于MS培養(yǎng)基，近年來Lv等[10]在誘導(dǎo)茶樹子葉愈傷組織中，采用改良ER培養(yǎng)基，并于25 ℃左右室溫中光培養(yǎng)25 d，也同樣獲得了優(yōu)質(zhì)的愈傷組織。

1.2.3 植物激素及外源添加物的選擇。植物激素在茶樹再生體系中發(fā)揮了重大作用，茶樹離體再生的影響因素除了培養(yǎng)基的種類和濃度，還包括植物激素和外源添加物。植物激素是茶樹組織形成、發(fā)育及分化等的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)[22]，不同類型外植體對(duì)植物激素需求不同，并且植物激素并非單一發(fā)揮作用，而是由多種類激素相互協(xié)同、共同調(diào)節(jié)的條件下促進(jìn)植物成長(zhǎng)發(fā)育[23]。茶樹遺傳轉(zhuǎn)化常見的外植體包括茶樹體胚、莖段及愈傷組織。在茶樹體胚培養(yǎng)中，有研究表明添加苯硼酸（PBOA）和芐基腺嘌呤（BA），或PBOA和激動(dòng)素（KIN）可高效誘導(dǎo)茶樹體胚增殖[24]，并且使用脫落酸（ABA）也可提高茶樹體胚的誘導(dǎo)率[25]。此外郭玉瓊等[23]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）最有利于茶樹體胚生長(zhǎng)。在莖段培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中僅添加極低濃度脫葉靈（TDZ）（1 pmol/L～100 nmol/L），能誘導(dǎo)茶樹莖尖增殖和維持較高增殖率[2]，Sandal等[26]利用BA替代TDZ也提高了莖段的分化率，但培養(yǎng)基中BA降解后會(huì)導(dǎo)致芽褐化和壞死，可見TDZ在茶樹莖段的離體再生中更具應(yīng)用潛力。有研究表明高濃度（1～10 μmol/L）的6-芐氨基嘌呤（BAP）結(jié)合萘乙酸（NAA）或吲哚丁酸（IBA）也能誘導(dǎo)茶樹莖段分化[22]，此外譚和平等[27]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素（CTK）與萘乙酸（IAA）共同使用對(duì)茶樹莖段的誘導(dǎo)效果較好。推測(cè)在茶樹莖段及體胚的離體培養(yǎng)中采用不同植物激素或激素組合，是由不同茶樹品種對(duì)植物激素的需求不同而造成的現(xiàn)象。同時(shí)在茶樹愈傷組織的培養(yǎng)中，有研究表明不同植物激素對(duì)茶樹愈傷組織誘導(dǎo)作用大小不同，表現(xiàn)為2，4-D > BA > NAA[21]。

甜菜堿、肉桂酸、椰乳（CM）、水解酪蛋白（CH）、蔗糖和山梨醇等是茶樹離體再生中常見營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[21]。郭玉瓊等[23]研究表明在培養(yǎng)基中添加3 mg/L 肉桂酸有利于茶樹體胚的增殖，且蔗糖或蔗糖與山梨醇的組合也有利于茶樹體胚的增殖。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的添加也可顯著促進(jìn)芽增殖，尤其是在芽分化初始期[2]，Jha等[28]研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加10% CM和1 000 mg/L CH能夠顯著增加莖尖、子葉和分化芽的數(shù)量。并且有研究表明在愈傷組織的繼代培養(yǎng)中添加AgNO3對(duì)轉(zhuǎn)化頻率的影響不大，但卻與預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基存在一定的相互促進(jìn)作用[29]。在茶樹離體培養(yǎng)中選擇MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加適量的植物激素、外源添加物等有利于茶樹的離體培養(yǎng)。

1.2.4 外植體褐化及調(diào)控。外植體褐化是茶樹離體培養(yǎng)的重點(diǎn)問題，有效控制褐化現(xiàn)象在茶樹受體系統(tǒng)建立甚至整個(gè)茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系中都至關(guān)重要。茶樹外植體褐化受內(nèi)部因素和外部因素的影響。

茶樹基因型不同是造成外植體褐化的主要內(nèi)部因素，駱穎穎等[15]對(duì)安吉白茶等9個(gè)不同茶樹品種進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)安吉白茶葉片褐化率達(dá)80%，福鼎大白茶達(dá)50%。茶樹的生理狀態(tài)、生長(zhǎng)季節(jié)和外植體類型等內(nèi)部因素對(duì)茶樹的離體培養(yǎng)也有影響。茶樹生理狀態(tài)不同，接種后褐化程度也不同，處于幼齡期的茶樹外植體褐化較淺，從成年茶樹植株取用的外植體褐化程度較重。茶樹生長(zhǎng)季節(jié)也很大程度影響外植體褐化，在茶樹莖段培養(yǎng)中春季腋芽褐化率比秋季的低[30]。此外茶樹莖段最易褐化，其次是葉片，子葉褐化率最低[2]。

培養(yǎng)基成分及其濃度、外源添加物和培養(yǎng)條件等外部因素度對(duì)外植體褐化程度也有影響。MS培養(yǎng)基中過高濃度的無機(jī)鹽會(huì)使褐化程度加深，駱穎穎等[15]認(rèn)為將鹽用量降低至MS培養(yǎng)基半量，可有效降低外植體褐化率。在外源添加物方面，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、維生素C、核黃素和活性炭等是常見的抗氧化劑和吸附劑。有研究表明，在茶樹外植體在接種前，使用2.0 g/L PVP 溶液浸泡30 min抑制褐化的效果最佳。黃燕芬等[31]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加維生素C和活性炭，褐化率由86% 下降至41%。鄔秀宏等[32]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加維生素C雖有效降低外植體褐化率，但在加熱條件下易分解出酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)基pH下降，而采用核黃素替代，降低褐化率效果更明顯，由57%下降至13.3%;同時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)、溫度過高以及光照過強(qiáng)等均會(huì)導(dǎo)致多酚氧化酶活性增強(qiáng)，從而加快褐變程度。有研究表明，在相對(duì)低溫情況下（8 ℃），外植體褐化率可明顯降低[30]。此外郭玉瓊等[13]發(fā)現(xiàn)對(duì)茶樹莖基部的切割方式也會(huì)影響褐化程度，選擇橫切可有效降低外植體褐化率。

2 茶樹遺傳轉(zhuǎn)化的方法及影響因素

2.1 茶樹遺傳轉(zhuǎn)化的方法

常規(guī)的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法主要分為農(nóng)桿菌法介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化法、種質(zhì)轉(zhuǎn)化法和直接基因轉(zhuǎn)化法3類。種質(zhì)轉(zhuǎn)化法包括花粉管通道法、生殖細(xì)胞浸泡法等;直接基因轉(zhuǎn)化法包括脂質(zhì)體包埋法、聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)法、顯微注射法、電激法、離子束法、激光微束法以及基因槍法等[12]。其中花粉管通道法是基因工程和常規(guī)育種結(jié)合起來的方法，花粉管通道法在茶樹遺傳轉(zhuǎn)化中有相關(guān)研究報(bào)道[33]，但轉(zhuǎn)化后的結(jié)實(shí)率明顯低于正常植株，技術(shù)有待進(jìn)一步完善。部分DNA直接基因轉(zhuǎn)移方法，如電擊法、顯微注射和PEG法等以原生質(zhì)體為轉(zhuǎn)化受體，要求高的原生質(zhì)體再生頻率，而茶樹原生質(zhì)體的再生基礎(chǔ)研究薄弱，研究難度較大[2]。目前茶樹遺傳轉(zhuǎn)化的方法多采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法[12]。

2.1.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（Agrobacterium mediated）。農(nóng)桿菌做為一種天然高效的轉(zhuǎn)基因載體，在植物遺傳轉(zhuǎn)化上應(yīng)用較廣[34]。自然界中存在的農(nóng)桿菌包括根癌農(nóng)桿菌（A.tumefaciens）和發(fā)根農(nóng)桿菌（A.rhizogenes）。根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化是最常見、應(yīng)用最廣泛的基因轉(zhuǎn)化途徑，轉(zhuǎn)基因植物中80%以上是利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的，它具有遺傳穩(wěn)定、轉(zhuǎn)化大片段的DNA、操作容易以及成本低等優(yōu)點(diǎn)[35]。自20世紀(jì)90年代以來，運(yùn)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功獲得多種植物抗性愈傷組織后，人們開始對(duì)茶樹的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行探索[8]，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，成為茶樹分子育種的新方向。目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茶樹遺傳轉(zhuǎn)化多采用根癌農(nóng)桿菌，發(fā)根農(nóng)桿菌的報(bào)道較少[2]。

Mondal等[8]首次利用根癌農(nóng)桿菌（EHA105和LBA4404）來感染茶樹體胚，將雙元質(zhì)粒p35GUS-INT所攜帶的nptⅡ基因和具有內(nèi)含子的gus基因?qū)氲讲铇潴w胚中，篩選出具有Kan抗性和GUS活性的體胚，再經(jīng)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)出嫩梢，最后將轉(zhuǎn)基因嫩梢嫁接在同種茶樹莖段上，獲得了轉(zhuǎn)基因茶樹。駱穎穎等[15]總結(jié)前人研究得出農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茶樹遺傳轉(zhuǎn)化的一般條件為：茶樹外植體經(jīng)3 d 預(yù)培養(yǎng)，農(nóng)桿菌液濃度OD值在0.8左右侵染15 min，25 ℃ 條件下共培養(yǎng)3 d。目前利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)茶樹遺傳轉(zhuǎn)化，大部分仍限于瞬時(shí)表達(dá)，穩(wěn)定表達(dá)技術(shù)有待提高[12]，遺傳轉(zhuǎn)化的檢測(cè)多采用GUS染色法和PCR檢測(cè)技術(shù)。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)茶樹遺傳轉(zhuǎn)化的重點(diǎn)問題是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率較低，產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因是茶樹中多酚類物質(zhì)含量較高，農(nóng)桿菌致病基因Vir基因在轉(zhuǎn)化時(shí)功能消減[6，36]。茶樹中的多酚類物質(zhì)具有抑菌作用和蛋白質(zhì)沉淀作用。抑菌作用直接導(dǎo)致農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)受到抑制，致使轉(zhuǎn)化效率降低，而蛋白質(zhì)沉淀作用使其對(duì)農(nóng)桿菌致病基因Vir基因起拮抗作用，阻塞了農(nóng)桿菌的T-DNA 向茶樹細(xì)胞運(yùn)轉(zhuǎn)的通道，從而間接影響農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率[6]。通過外部條件的優(yōu)化可提高農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率，Sandal等[11]研究表明采用多酚吸附劑和抗氧化劑雖不能解決農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率低的問題，但在共培養(yǎng)階段添加適量的L-谷氨酰胺（L-Gln），可減輕多酚類物質(zhì)的抑菌作用。通過選用抗酚菌株或減少農(nóng)桿菌與茶樹外植體接觸部位的多酚濃度等，也可提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率。茶樹是一種富含多酚類物質(zhì)的多年生木本植物，多酚類的抑菌作用使得農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茶樹遺傳轉(zhuǎn)化困難[37]，建立一套穩(wěn)定完善的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系是解決目前轉(zhuǎn)化效率低的重要途徑[12]。

2.1.2 基因槍法（ bombardmentmediated or biolistic gunmediated）。基因槍法也叫生物彈法，是目前除了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法外應(yīng)用最廣泛的方法。與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法相比，基因槍法不限于受體植物的范圍，載體質(zhì)粒構(gòu)建較為簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化率也較高[29]?；驑尫ǖ脑硎菍⑼庠碊NA包被在微小金?；蜴u粒表面，利用高壓作用，將微粒高速射入受體細(xì)胞或組織內(nèi)，微粒上外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后，整合到植物染色體上得到表達(dá)，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化。基因槍轟擊效率的高低與受體生理狀態(tài)、轟擊條件和轟擊用微彈性狀等因素有關(guān)[38]。

20 世紀(jì)90 年代，研究人員將基因槍技術(shù)首次應(yīng)用到茶樹遺傳轉(zhuǎn)化研究上，并比較了基因槍不同發(fā)射壓力、入射次數(shù)對(duì)體胚再生頻率的影響，結(jié)果顯示：?jiǎn)螛屓肷鋾r(shí)發(fā)射壓力1 100～1 300 psi的再生頻率在20% ～ 30% ;轟擊2次時(shí)，1 300 psi會(huì)造成過多傷口，不易再生新的體胚[12]。吳姍等[38]對(duì)茶樹基因槍轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化，構(gòu)建制彈程序?yàn)椋?0 mg/mL鎢粉懸浮液10 μL中加入1.6 μL質(zhì)粒DNA（1 μg/μL），再分別加入0.1 mol/L的亞精胺4 μL，2.5 mol/L 的CaCl2 15 μL，最后定容至48 μL;每次轟擊上樣量為8～10 μL。此外吳姍等[29]對(duì)基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化茶樹愈傷的參數(shù)優(yōu)化，得出：每槍DNA和鎢粉用量分別為0.25、125 μg 可得到較高轉(zhuǎn)化率;在轟擊壓力7MPa，射程5 cm的條件下，不論對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)還是愈傷再生都是較為適合的轟擊條件。并且Saini等[9]利用入射壓力7.58 MPa、轟擊距離9 cm的參數(shù)將質(zhì)粒DNA 1.0 μg轟入茶樹體胚，也可成功獲得目標(biāo)基因的表達(dá)。

2.2 影響茶樹遺傳轉(zhuǎn)化的因素

遺傳轉(zhuǎn)化過程中一般經(jīng)預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)（農(nóng)桿菌介導(dǎo)法需要）、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因再生等多個(gè)環(huán)節(jié)。侵染茶樹外植體時(shí)農(nóng)桿菌菌種、菌液濃度和侵染時(shí)間及共培養(yǎng)時(shí)間、溫度、光照條件和真空度等都會(huì)對(duì)茶樹遺傳轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生影響[38]。為了獲得高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體系，茶樹外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌浸染、基因槍轟擊的條件需進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2.1 預(yù)培養(yǎng)條件。茶樹遺傳轉(zhuǎn)化的預(yù)培養(yǎng)條件包括預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、基本培養(yǎng)基以及外源添加物。茶樹外植體在進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染前，進(jìn)行一段時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)可使外植體處于感受態(tài)，有效提高轉(zhuǎn)化率。有研究表明2～3 d的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間最適宜，此外以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加適量的PVP，可顯著提高轉(zhuǎn)化效率[38]。此外張根義等[39]利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草中發(fā)現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中含有Ca2+可誘導(dǎo)外植體處于感受態(tài)，使轉(zhuǎn)化效率提高;而吳姍等[38]在農(nóng)桿菌介導(dǎo)茶樹遺傳轉(zhuǎn)化中也在預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加CaCl2，但轉(zhuǎn)化率明顯降低，推測(cè)茶樹是嫌鈣植物，對(duì)Ca2+的敏感度比煙草高。

2.2.2 共培養(yǎng)條件。茶樹遺傳轉(zhuǎn)化的共培養(yǎng)條件包括共培養(yǎng)時(shí)間、基本培養(yǎng)基以及外源添加物。共培養(yǎng)是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茶樹遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，有研究表明共培養(yǎng)2 d 最有利于提高茶樹的轉(zhuǎn)化效率[10]。常見共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，但存在著誘導(dǎo)頻率低、重復(fù)性差等問題。共培養(yǎng)培養(yǎng)基使用YEB培養(yǎng)基效果更佳，張廣輝等[40]以YMB為共培養(yǎng)的培養(yǎng)基，獲得了高的發(fā)根誘導(dǎo)頻率，Lv等[10]對(duì)比YEB培養(yǎng)基和ER培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)使用YEB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化率較高。

共培養(yǎng)階段添加適量的外源添加物可促進(jìn)轉(zhuǎn)化率的提高。乙酰丁香酮（AS）是共培養(yǎng)中常見的外源添加物，AS可誘導(dǎo)農(nóng)桿菌中Vir基因以及Ti質(zhì)粒上repABC 操縱子的表達(dá)，促進(jìn)農(nóng)桿菌侵染并提高轉(zhuǎn)化率[41]。Hiei等[42]認(rèn)為添加AS是促使農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵;茶樹中酚類物質(zhì)很大程度上限制了農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化率，但添加適量AS也可茶樹的轉(zhuǎn)化率。項(xiàng)威等[6]研究表明，添加100 μmol/L AS對(duì)茶樹愈傷組織轉(zhuǎn)化最有利。近年來Lv等[10]發(fā)現(xiàn)150 μmol/L AS對(duì)茶樹愈傷組織的轉(zhuǎn)化最適宜，而濃度過高的AS，會(huì)導(dǎo)致外植體的中毒死亡。有研究表明糖類物質(zhì)可協(xié)助AS等物質(zhì)誘導(dǎo)高水平的Vir基因表達(dá)，提高茶樹的轉(zhuǎn)化率[43]。此外程振東等[44]研究表明，添加AgNO3可提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜的效率;而趙東等[45]在茶樹中同樣添加AgNO3，發(fā)現(xiàn)非但不能促進(jìn)茶樹轉(zhuǎn)化率或GUS瞬時(shí)表達(dá)，反而使其降低，推測(cè)Ag+ 對(duì)農(nóng)桿菌具有毒害作用，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率和GUS瞬時(shí)表達(dá)降低。

2.2.3 脫菌抗生素的選擇。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茶樹遺傳轉(zhuǎn)化中，使用脫菌抗生素能有效抑制農(nóng)桿菌活性，防止其危害茶樹組織及細(xì)胞[46]。分析不同種類脫菌抗生素對(duì)農(nóng)桿菌的抑菌效果及外植體對(duì)抗生素濃度的敏感度是建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系的關(guān)鍵。茶樹遺傳轉(zhuǎn)化中常見脫菌抗生素有頭孢霉素（Cef）、羧芐青霉素（Car）、潮霉素（Hyg）和特美?。═im）等。Mondal等[8]研究表明Cef和Car協(xié)同使用，可抑制根癌農(nóng)桿菌（EHA105和LBA4404）的活性，且對(duì)茶樹體胚生長(zhǎng)和器官發(fā)生的影響不顯著。田麗麗等[47]研究表明Tim 300 mg/L 較Cef 400 mg/L與Hyg 15 mg/L協(xié)同使用更有效抑制根癌農(nóng)桿菌（GV3101），且顯著促進(jìn)茶樹體胚增殖。研究表明單一抗生素的使用會(huì)使農(nóng)桿菌產(chǎn)生抗藥性，抗生素混合使用能有效減少農(nóng)桿菌的抗藥性[48]，根據(jù)不同農(nóng)桿菌選擇適合的抗生素并交替使用，可有效降低農(nóng)桿菌抗藥現(xiàn)象的發(fā)生。

2.2.4 篩選試劑的選擇。在選擇培養(yǎng)基中使用篩選試劑會(huì)產(chǎn)生一定的選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化的外植體生長(zhǎng)發(fā)育不良最終死亡。篩選試劑濃度依據(jù)外植體類型不同而存在差異[15]，茶樹遺傳轉(zhuǎn)化中常見篩選試劑為卡那霉素（Kan）和潮霉素（Hyg），且Hyg的篩選效果優(yōu)于Kan。趙東等[45]研究表明當(dāng)葉片愈傷組織切成足夠小薄片，Kan才會(huì)起到篩選作用。駱穎穎等[15]也發(fā)現(xiàn)茶樹愈傷組織對(duì)Kan不敏感，當(dāng)Kan濃度高達(dá)到200 mg/L時(shí)，未轉(zhuǎn)化的愈傷組織仍未完全死亡;而Hyg濃度僅20 mg/L，即可使未轉(zhuǎn)化的愈傷組織幾乎不生長(zhǎng)，并且14 d后未轉(zhuǎn)化的愈傷組織全部褐化死亡。

3 小結(jié)與討論

茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系面臨的主要問題是離體再生難和轉(zhuǎn)化效率低[3]。茶樹遺傳轉(zhuǎn)化的受體多采用體胚、莖段和愈傷組織等，外植體的離體再生率仍有待提高。茶樹體胚和莖段是最具潛力的受體材料，但茶樹莖段誘導(dǎo)率較低，體胚運(yùn)用仍較廣泛，如Mondal等[8]、Jeyaramraja等[49]和Singh等[50]均利用茶樹體胚成功獲得了轉(zhuǎn)基因茶樹，但存在的問題是體胚遺傳背景與母體之間有較大差異且誘導(dǎo)周期長(zhǎng)。茶樹愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化多應(yīng)用于GUS瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證，從愈傷組織實(shí)現(xiàn)植株再生是茶樹等木本植物需突破的重要技術(shù)瓶頸。原位轉(zhuǎn)化技術(shù)是直接將茶樹活體與農(nóng)桿菌接觸，減緩了酚類物質(zhì)的抑菌作用，其根本特點(diǎn)在于不需組織或細(xì)胞培養(yǎng)手段，而達(dá)到植物在活體狀態(tài)下的轉(zhuǎn)化[51]。目前原位轉(zhuǎn)化技術(shù)在植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)中研究較廣泛，擬南芥[52]、苜蓿[53]、白菜[54]和蘿卜[55]等植物上均有相關(guān)研究進(jìn)展，而茶樹采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率低的原因是由于茶樹組織中的酚類物質(zhì)具有殺菌作用，從而抑制農(nóng)桿菌侵染率，茶樹遺傳轉(zhuǎn)化中采用原位轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究較少，Alagarsamy等[56]利用發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)60 d齡的茶樹品種“農(nóng)抗早”的下胚軸進(jìn)行侵染，并保持在高濕環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，60 d后88.3%侵染部位發(fā)育成毛狀根。因此將農(nóng)桿菌介導(dǎo)的原位轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用到茶樹轉(zhuǎn)基因中具有前景。

茶樹對(duì)農(nóng)桿菌不敏感，轉(zhuǎn)化效率偏低是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的主要難題[29]，基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率較農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高，但此項(xiàng)技術(shù)仍需完善，如儀器可控性、準(zhǔn)確性、精確性和轟擊后進(jìn)入受體細(xì)胞DNA的生物學(xué)變化及其調(diào)控機(jī)理等[6]。吳姍等[29]發(fā)現(xiàn)利用農(nóng)桿菌侵染和基因槍轟擊相結(jié)合的技術(shù)，比起兩種方法單獨(dú)使用，更有助于提高茶樹的轉(zhuǎn)化率，農(nóng)桿菌侵染與基因槍轟擊相結(jié)合能有效提高轉(zhuǎn)化率，可將這兩項(xiàng)技術(shù)充分發(fā)揮在茶樹遺傳轉(zhuǎn)化的研究中。此外花粉管通道法在茶樹遺傳轉(zhuǎn)化也有待完善，應(yīng)避免人工處理時(shí)對(duì)花器造成的機(jī)械傷害，提高轉(zhuǎn)化后的結(jié)實(shí)率[33]。此外可借鑒在其他植物中應(yīng)用的生殖細(xì)胞浸泡法、PEG介導(dǎo)法、顯微注射技術(shù)、電激法、離子束法和激光微束法等遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，填補(bǔ)茶樹遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)空白。

茶樹次生代謝產(chǎn)物種類繁多且在生化分析上取得較多成果[57-58]，但重要次生代謝產(chǎn)物的代謝途徑及基因調(diào)控方面的研究較少，可通過茶樹遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，完善建立轉(zhuǎn)基因體系，研究茶樹次生代謝的基因調(diào)控[12]。此外，利用茶樹遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)也可進(jìn)行茶樹抗逆能力改良，將抗病蟲、抗寒、抗旱等基因?qū)氩铇渲衼硖岣卟铇淇剐裕缋眠z傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將抗病蟲基因（Bt基因）導(dǎo)入茶樹中，提高茶樹抗病蟲能力，獲得抗病蟲轉(zhuǎn)基因新品種，有效降低茶葉的農(nóng)殘問題[59]，從根源上提高茶樹抗性，培育出具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和適宜當(dāng)?shù)丨h(huán)境的新品種，使茶樹品種選育滿足生產(chǎn)和市場(chǎng)的需求。

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