倪添雨，張雅潔，劉 敏，裴仁軍

(中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所，江蘇 蘇州 215123)

1 前 言

隨著醫(yī)療手段的進(jìn)步，器官移植和修復(fù)技術(shù)得到了極大的發(fā)展，器官移植也已成為終末期器官疾病的主要治療手段。但由于目前供體器官極度短缺，器官移植很受限制。近年來，組織工程技術(shù)飛速發(fā)展，人們已經(jīng)可以在體外培養(yǎng)各種仿生組織或器官以供器官移植，比如已經(jīng)有了應(yīng)用組織工程制造的胃、骨、皮膚、脊髓、食道等。但傳統(tǒng)的人造器官或仿生支架無生理活性，還存在諸多不足，譬如：支架技術(shù)的空間分辨率限制了細(xì)胞滲透到支架材料內(nèi)部的速度，細(xì)胞不能均勻貫穿整個支架；無法精確地將不同種類的細(xì)胞按照人體組織器官的結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確定位，不能形成類似于天然組織器官的三維結(jié)構(gòu)；直接使用支架接種細(xì)胞可能會導(dǎo)致血管化的缺失、供氧不足、容易引起組織或器官的壞死等[1]。

直至2003年,Mironov等[2]基于生物自組裝原理提出“細(xì)胞打印”的設(shè)想。細(xì)胞打印技術(shù)能夠?qū)⒓?xì)胞、生長因子和支架結(jié)合在一起形成一個完整的整體結(jié)構(gòu)，且各種類型的細(xì)胞能夠按照正常的解剖結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確定位，通過細(xì)胞、生長因子和支架等之間的相互作用，行使正常的生物學(xué)功能(見圖1[3])。細(xì)胞打印技術(shù)發(fā)展至今，已經(jīng)有了相對成熟的3種方式，分別是：擠出成型打印、噴墨打印和激光輔助打印[4]，3者中擠出成型打印方法簡單、價格低廉，是目前使用最廣泛的細(xì)胞打印方式。擠出成型打印是指以受控方式迫使生物材料通過噴嘴噴射含有細(xì)胞的連續(xù)長絲以構(gòu)造3D結(jié)構(gòu)的技術(shù)[5]。其中，生物材料通常指水凝膠，利用其高含水量、優(yōu)良的生物相容性和溫和的凝膠條件，促進(jìn)細(xì)胞封裝，把不利于細(xì)胞活性的影響降至最低[6,7]。目前最常用的水凝膠材料有聚乙二醇(PEG)、海藻酸鹽、殼聚糖、透明質(zhì)酸和膠原蛋白等。其中，膠原蛋白是一種廣泛存在于人體組織內(nèi)的蛋白質(zhì)，具有接近正常組織表面的生理生化特性和優(yōu)良的生物可降解性，是一種優(yōu)良的組織工程材料[8]。

圖1 在大鼠顱骨缺損處用噴墨打印纖維蛋白原、凝血酶和顯像染料驗(yàn)證原位生物打印的可行性[3]Fig.1 Conceptual vision of in-situ bioprinting,with feasibility demonstrated by inkjet printing fibrinogen,thrombin and visualization dye into a rat calvarial defect[3]

而在細(xì)胞的選擇上，干細(xì)胞相較于分化完全的功能細(xì)胞有著明顯的優(yōu)勢。干細(xì)胞具有長期的自我更新能力和廣泛的分化潛能，理論上可以提供無限數(shù)量的細(xì)胞[9]。干細(xì)胞來源廣，在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)下能進(jìn)行定向分化，能更好地促進(jìn)器官修復(fù)與再生。因此，干細(xì)胞3D打印被認(rèn)為是組織工程中最有潛力的技術(shù)。

2 干細(xì)胞3D共打印

正常的生理組織具有自我更新和修復(fù)能力，參與修復(fù)更新的主要是組織特異性干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等。隨著干細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展，干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、移植等方面都取得了突破性的進(jìn)展，并越來越多地應(yīng)用于臨床治療中。至2016年底，全球已有13種干細(xì)胞治療藥物獲批上市，可用于治療急性心肌梗死、退行性關(guān)節(jié)炎、赫爾勒綜合征等疾病[10]。

在干細(xì)胞治療中，最有治療潛力的細(xì)胞是多能干細(xì)胞(PSCs)，包括胚胎干細(xì)胞(ESCs)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)[9]。但ESCs的臨床應(yīng)用受到倫理限制，iPSCs的臨床應(yīng)用受到安全性(尤指致瘤風(fēng)險)、臨床療效及成本等限制，所以目前干細(xì)胞治療以成體干細(xì)胞治療為主[10]。成體干細(xì)胞治療根據(jù)部位的不同，可以選用間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)及神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)等。表1列舉了常見的干細(xì)胞、支架材料及其應(yīng)用。

傳統(tǒng)的細(xì)胞支架是在已成型的支架中種植細(xì)胞，體外培養(yǎng)后再植入體內(nèi)，這種方式難免會遇到諸多組織移植的問題，如支架技術(shù)的空間分辨率低、細(xì)胞不能滲透到支架內(nèi)部、血管化的缺失導(dǎo)致組織供養(yǎng)不足及壞死等。而干細(xì)胞的狀態(tài)及行為與其生存的微環(huán)境密切相關(guān)，支架材料的硬度、表面特征、孔隙結(jié)構(gòu)、降解性等對干細(xì)胞的活性和功能也有一定的影響，同時，材料的化學(xué)組成會影響細(xì)胞的粘附、遷移、增殖和后續(xù)組織的形成[30]。良好的支架材料應(yīng)該既能為細(xì)胞提供增殖和分泌基質(zhì)的微環(huán)境，又能維持細(xì)胞表型以及功能的表達(dá)。因此，選用細(xì)胞包埋水凝膠比傳統(tǒng)支架形成后種植細(xì)胞有更多優(yōu)點(diǎn)，包括能更好地注入細(xì)胞和控制細(xì)胞分布等[31]。

表1 水凝膠封裝干細(xì)胞的應(yīng)用舉例Table 1 Examples of stem cells encapsulated by hydrogel

Notes：CPCs：Cardiac progenitor cells；PCL：Polycaprolactone；PAM：Polyacrylamide；PU：Polyurethane；PEG：Polyethylene glycol；PLGA：Poly(lactic-co-glycolic acid)

3 膠原蛋白及其細(xì)胞支架

膠原蛋白是人體中分布最廣泛的蛋白質(zhì)，大約占蛋白質(zhì)總量的30%[32]，在脊椎動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了28種不同的膠原蛋白，類膠原蛋白的種類更加豐富[33]。膠原蛋白分子存在獨(dú)特的功能域，是由3條左旋且平行的α鏈形成的三螺旋結(jié)構(gòu)。甘氨酸在三螺旋結(jié)構(gòu)中有至關(guān)重要的地位，因?yàn)樗亲钚〉陌被幔鼙蝗菪Y(jié)構(gòu)緊密包裹在內(nèi)部[34]；此外，該結(jié)構(gòu)中還存在許多垂直于螺旋軸的氫鍵，將肽鏈緊密地連接在一起，使三螺旋結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[35]。

膠原蛋白作為一種天然生物大分子材料，來源廣泛且與人體多數(shù)組織的生理性質(zhì)相近，已被廣泛地應(yīng)用于組織工程中，尤其是血管[36]和骨組織[37]修復(fù)。并且膠原蛋白中含有的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列可以與干細(xì)胞相互作用，制成的3D膠原支架可以增加細(xì)胞的粘附、增殖和分化[38]，同時，膠原支架的降解成分在新組織形成過程中可以被細(xì)胞重復(fù)利用，十分有利于促進(jìn)組織修復(fù)[39]。但單純的膠原蛋白用于組織支架制備，存在難于塑形、缺乏一定的力學(xué)性能、在生物體內(nèi)降解過快等問題。為了滿足組織修復(fù)中的復(fù)雜需求，膠原蛋白通常與其他高分子材料復(fù)合，制造出功能各異的細(xì)胞支架。

在膠原蛋白中添加其他天然的高分子材料可以發(fā)揮它們不同的理化性質(zhì)，優(yōu)勢互補(bǔ)，能更好地促進(jìn)細(xì)胞粘附、生長和增殖。Madhavan等[36]在膠原凝膠中加入彈性蛋白及殼聚糖，其拉升率和極限應(yīng)力明顯提高。Buttafoco等[40]將膠原蛋白和彈性蛋白以1∶1的比例共混電紡，制備出的纖維膜支架能很好地支持血管平滑肌細(xì)胞生長及增殖。同樣地，膠原蛋白復(fù)合絲素蛋白[41]、透明質(zhì)酸[42]等天然高分子材料后，力學(xué)性能都有明顯提升。

雖然天然高分子的生物相容性好，但其機(jī)械性能、降解速率等還不能媲美許多人工合成的高分子材料，所以研究者們也使用膠原蛋白與人工合成高分子復(fù)合，以制備性能優(yōu)良的組織工程支架。其中常用于與膠原蛋白復(fù)合的人工合成高分子材料有聚己內(nèi)酯(PCL)、聚對二氧雜環(huán)己酮(PDO)和聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)等。膠原蛋白與PCL共混后電紡制備的支架力學(xué)強(qiáng)度高、能在體內(nèi)保持穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，有望成為傳統(tǒng)人工血管的代替物[43]。PDO與其他材料相比，具有形狀記憶功能、力學(xué)性能理想、抗原性低和降解速率慢等特性，與膠原蛋白共混后進(jìn)行電紡得到的支架，可以模擬血管微環(huán)境的力學(xué)和形態(tài)學(xué)性能[44]。膠原蛋白復(fù)合PLGA制備的支架能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附及延伸，并保持細(xì)胞表型[43]。

膠原蛋白支架發(fā)展至今，已有許多機(jī)械強(qiáng)度、降解速度、細(xì)胞親和力都有很好改善的仿生支架面市?？偠灾?，現(xiàn)有的膠原仿生支架大多是通過交聯(lián)、側(cè)鏈引入等方法將膠原蛋白與其他材料復(fù)合制備的，而在支架制備工藝上使用較多的是經(jīng)典的靜電紡絲法、冷凍干燥法、氣體發(fā)泡法和致孔劑制孔法等。然而，這些方法制備的支架存在孔徑大小和空間分布難以控制等不足[45]，無法為細(xì)胞提供最佳的生存空間。基于膠原蛋白利用3D打印技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞3D打印一體化策略，一方面利用3D打印技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速、精確、可控地構(gòu)造仿生組織替代物，另一方面利用膠原蛋白的特性為細(xì)胞提供良好的微環(huán)境，提高細(xì)胞的存活率和增殖率。

4 基于膠原蛋白的干細(xì)胞3D打印

4.1 物理凝膠法

物理交聯(lián)水凝膠主要是通過高分子鏈間的纏結(jié)或者非化學(xué)鍵(如氫鍵和親/疏水相互作用等)形成，具有動態(tài)特征，可以實(shí)現(xiàn)溶液-凝膠的可逆變化。常見的物理凝膠方法有熱誘導(dǎo)的鏈纏結(jié)、分子自組裝等[46]。

4.1.1 熱誘導(dǎo)的鏈纏結(jié)致凝膠化

許多聚合物的凝膠化是由熱驅(qū)動的過程，它們對溫度升高或降低響應(yīng)的直接表現(xiàn)為溶解度的改變，實(shí)際是親水和疏水鏈段比率的改變，所以又被稱為具有“溫敏性”。根據(jù)轉(zhuǎn)變行為的不同，分別定義為低臨界溶解溫度(LCST)和高臨界溶解溫度(UCST)[46]。

在干細(xì)胞3D打印中，這種具有溫敏性的可注射水凝膠是研究熱點(diǎn)。Tan等[47]使用PLGA封裝細(xì)胞形成多孔微球，再混合膠原蛋白/瓊脂溶液，利用微管擠壓法在冷平臺上打印，可立即形成復(fù)合水凝膠。37 ℃孵育24 h，水凝膠中形成膠原纖維，為細(xì)胞提供更好的附著(如圖2)。Wang等[48]將人MSCs封裝進(jìn)一種由Ⅰ型膠原蛋白、硫酸軟骨素和一種復(fù)雜聚合物組成的復(fù)合水凝膠，其中的復(fù)雜聚合物是N-異丙基丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酰氧基琥珀酰亞胺、聚(環(huán)丙烷碳酸鹽)甲基丙烯酸羥乙基酯的嵌段共聚物，在室溫附近顯示出具有LCST的相變行為。該水凝膠需要在4 ℃下注射成型，能夠在37 ℃的環(huán)境中于6 s內(nèi)發(fā)生凝膠化。這種復(fù)合型水凝膠具有與人類心肌相匹配的模量和柔性、良好的可注射性、透氧性、力學(xué)性能和可降解性，可用作心血管組織工程中生長因子和細(xì)胞的載體。Song等[49]將人源脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)與殼聚糖/β-甘油磷酸鹽/膠原蛋白混合，37 ℃下很快形成凝膠。殼聚糖/β-甘油磷酸鹽是一種溫敏型水凝膠，膠原蛋白的參與可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，維持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞活性。這種新型水凝膠具有良好的組織相容性，為ADSCs的生長提供了良好的三維微環(huán)境。

熱誘導(dǎo)的鏈纏結(jié)致凝膠化方法，不利用其它誘導(dǎo)條件，如pH調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)劑、UV光等，僅通過溫度控制膠原復(fù)合水凝膠快速成型，凝膠中的干細(xì)胞和生長因子的生物活性可以得到很好的保存，在干細(xì)胞3D打印中有著很好的應(yīng)用前景。

4.1.2 自組裝致凝膠化

非化學(xué)鍵分子自組裝是一種重要的凝膠化機(jī)理，在蛋白質(zhì)水凝膠中尤為常見。自組裝的定義是在沒有外部的干預(yù)下，分子鏈在至少一個維度上自發(fā)形成新的有序結(jié)構(gòu)。弱非共價鍵，包括氫鍵、范德華力和疏水相互作用，能使大分子折疊成具有明確定義的結(jié)構(gòu)和功能構(gòu)象。膠原蛋白的分層自組裝依賴于其氨基酸排列，由三螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)一步促成膠原微纖維，最終形成膠原水凝膠[46]。

膠原蛋白水凝膠在成分和結(jié)構(gòu)上與天然細(xì)胞外基質(zhì)相似，且對成骨分化有著促進(jìn)作用，被廣泛用于三維基質(zhì)以支持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的增殖和分化。Zhang等[50]提取小牛皮膚的膠原蛋白，在中性條件下與新生兔BMSCs混合注入模具，30 min實(shí)現(xiàn)凝膠化。結(jié)果表明在無任何生長因子添加的條件下，膠原水凝膠對BMSCs仍具有固有的成軟骨分化誘導(dǎo)性，對臨床軟骨再生有極大幫助。

除了直接將干細(xì)胞封裝在水凝膠中，研究者們還提出了使用納米微球封裝干細(xì)胞的概念，與水凝膠一起使用可以增加細(xì)胞橋接作用。DeVolder等[51]通過在凝膠內(nèi)摻入可水解的PLGA微粒來調(diào)節(jié)膠原蛋白凝膠的機(jī)械性能。一定直徑的PLGA微球能刺激膠原原纖維的物理締合作用，顯著改變凝膠的彈性和硬度，同時對凝膠的抗?jié)B透性影響很小。Chen等[52]使用水包油包水雙乳液溶劑蒸發(fā)法制備3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的共聚物(PHBV)微球，將小鼠神經(jīng)前體細(xì)胞(NPCs)接種在PHBV微球上，再將含有細(xì)胞的微球、層粘連蛋白、神經(jīng)生長因子(NGF)等封裝入膠原蛋白中，37 ℃下孵育2 h以形成水凝膠，這種水凝膠通過更緊密的包裝以及將細(xì)胞接種到凝膠空間中可進(jìn)一步促進(jìn)基質(zhì)材料與細(xì)胞橋接。

4.2 離子作用凝膠法

海藻酸鹽是從褐藻中提取的一種無規(guī)嵌段共聚物，其水溶液在許多二價金屬陽離子(如Ca2+、Zn2+等)的作用下會發(fā)生分子鏈和離子的螯合作用，使海藻酸鹽分子鏈形成螺旋狀結(jié)構(gòu)并成對地包裹和環(huán)繞在陽離子周圍。由于海藻酸鹽溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變過程條件溫和，其本身對細(xì)胞沒有明顯的負(fù)面作用，且在需要的時候可發(fā)生可逆轉(zhuǎn)變，因而被廣泛用于細(xì)胞封裝。

海藻酸鹽可以很好地與膠原蛋白復(fù)合成細(xì)胞載體，在干細(xì)胞打印中有很好的應(yīng)用前景。Nguyen等[53]利用海藻酸鹽和Ca2+的交聯(lián)作用，用膠原蛋白/海藻酸鹽封裝人MSCs和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，擠出至培養(yǎng)基中孵育，交聯(lián)成型后分別進(jìn)行了動態(tài)培養(yǎng)和靜態(tài)培養(yǎng)，證明了膠原蛋白在促進(jìn)成骨和血管生成方面有獨(dú)特功能。

隨著生物3D打印技術(shù)的不斷進(jìn)步，研究者們越來越不滿足于單一結(jié)構(gòu)的打印方式，其中最典型的是利用海藻酸鹽和膠原蛋白復(fù)合的核-殼打印方式。Olmos等[54]設(shè)計了用于細(xì)胞包封的大鼠Ⅰ型膠原蛋白/海藻酸鹽核-殼結(jié)構(gòu)水凝膠，他們用同心雙噴嘴同時噴射注有大鼠BMSCs的膠原蛋白溶液的核和含海藻酸鹽溶液的殼，在氯化鈣離子浴中制備雙層水凝膠結(jié)構(gòu)，以獲得纖維結(jié)構(gòu)的支架。該研究在殼結(jié)構(gòu)中加載生物活性分子，比如藥物、生長因子或是基因等，在細(xì)胞靶向治療和組織工程應(yīng)用中具有極好的前景。Perez等[55]也使用了膠原蛋白/海藻酸鹽的核-殼結(jié)構(gòu)封裝兔MSCs，裝載有MSCs的膠原溶液作為核，海藻酸鹽溶液作為殼,通過鈣離子交聯(lián)成型，再進(jìn)一步孵育用于骨組織工程的細(xì)胞培養(yǎng)。這種生物墨水可由生物3D打印機(jī)模塑成任何確定的形狀，其本身也可保持連續(xù)的纖維結(jié)構(gòu)。Yeo等[56]通過計算機(jī)控制的三軸打印系統(tǒng)打印了多層的載有細(xì)胞的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。他們使用Ⅰ型豬腱膠原蛋白混合人ADSCs作核結(jié)構(gòu)，以純海藻酸鹽作為殼結(jié)構(gòu)，使用氯化鈣溶液進(jìn)行氣溶膠處理以暫時交聯(lián)殼層中的海藻酸鹽部分，使得載有細(xì)胞的膠原組分可以穩(wěn)定地保留在圓柱形核-殼的核心區(qū)域中。此復(fù)合型水凝膠在成肝誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)后，表現(xiàn)出高水平的肝特異性基因表達(dá)，說明使用這種組合工藝制造的載有細(xì)胞的核-殼結(jié)構(gòu),可能具有作為用于組織再生的細(xì)胞負(fù)載結(jié)構(gòu)的顯著潛力。

單純的海藻酸鹽水凝膠存在細(xì)胞附著點(diǎn)少、交聯(lián)后收縮、降解性差等缺點(diǎn)，即使經(jīng)較長期的培養(yǎng)，海藻酸鹽與細(xì)胞構(gòu)建體仍缺乏如膠原原纖維和蛋白多糖類的連續(xù)網(wǎng)絡(luò)，這對于組織工程支架的應(yīng)用是不利的。而海藻酸鹽復(fù)合膠原蛋白水凝膠結(jié)合了兩者的優(yōu)勢，有著良好的生物相容性、廣泛的來源和較強(qiáng)的可塑性等特點(diǎn)，尤其是在二價陽離子中交聯(lián)速度極快、可在細(xì)胞存活的條件下成膠，呈現(xiàn)出“1+1>2”的效應(yīng)。

4.3 共價作用凝膠法

化學(xué)交聯(lián)水凝膠則是通過高分子鏈間的共價鍵交聯(lián)形成，與物理交聯(lián)水凝膠相比，化學(xué)交聯(lián)在穩(wěn)定水凝膠基質(zhì)方面表現(xiàn)更好。研究者們也已經(jīng)設(shè)計了多種生物相容的化學(xué)反應(yīng)用于在基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞存在的條件下直接形成水凝膠[46]。

4.3.1 光引發(fā)致凝膠化

某些化合物在特定波長光的照射下會產(chǎn)生活性中心，從而引發(fā)聚合反應(yīng)，在空間中聯(lián)結(jié)成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)而形成水凝膠，比較典型的有核黃素和甲基丙烯酸修飾的大分子等。

核黃素又被稱為維生素B2，在堿性條件下易被破壞。核黃素誘導(dǎo)的膠原蛋白光交聯(lián)是一種非細(xì)胞毒性的交聯(lián)方式，能強(qiáng)化水凝膠的機(jī)械性能。Koh等[57]研發(fā)了一種核黃素誘導(dǎo)的光交聯(lián)膠原蛋白/透明質(zhì)酸水凝膠，紫外光照射3 min即可使凝膠成型。用這種水凝膠包封扁桃體衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞(T-MSCs)，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的BMSCs應(yīng)用于半月板組織工程，能刺激纖維軟骨相關(guān)的基因表達(dá)，也能一定程度上解決同種異體移植的問題。Choi等[58]將甲基丙基酸修飾到殼聚糖上，混合雞胸骨Ⅱ型膠原蛋白和MSCs，并以核黃素作為光引發(fā)交聯(lián)劑，暴露于可見藍(lán)光(VBL)下幾十秒之后形成水凝膠。其中摻入的轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)進(jìn)一步增強(qiáng)了MSCs的成軟骨分化能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，皮下植入該水凝膠干細(xì)胞共混培養(yǎng)物后，顯示出很高的軟骨修復(fù)潛力。

甲基丙烯酸酯基團(tuán)中含有共軛雙鍵，用其修飾的蛋白在紫外光的照射下易轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，產(chǎn)生活性中心從而引起光化學(xué)反應(yīng)。Yang等[59]利用膠原蛋白上的賴氨酸與甲基丙烯酸酐上的ε-氨基發(fā)生酰胺化反應(yīng)合成Ⅱ型膠原甲基丙烯酰胺，使膠原能夠?qū)崿F(xiàn)光交聯(lián)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，功能化修飾不僅保護(hù)了膠原蛋白的天然三螺旋構(gòu)象，而且賦予其光交聯(lián)能力，可用于有明確定義的復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)的精細(xì)加工，為3D細(xì)胞打印提供了一種理想的生物墨水材料。Gaudet等[60]用甲基丙烯酸酯功能化修飾膠原蛋白，這種合成反應(yīng)可以保留膠原蛋白的基本性質(zhì)，并使其在波長為365 nm的紫外光照射下發(fā)生凝膠化，且儲能模量比修飾前增加5倍，其封裝的人源MSCs也能很好地存活。Du等[61]將帶有膠原結(jié)合域的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(CBD-BMP2)微纖維、BMSCs以及甲基丙烯酰胺修飾的明膠共混液，3D打印出一定形貌后以光引發(fā)劑I2959作交聯(lián)劑紫外光照射1～5 min可發(fā)生凝膠化，結(jié)果表明該膠原微纖維可以更安全有效地誘導(dǎo)BMSCs分化為成骨細(xì)胞。

PEG是公認(rèn)的一種良好的生物材料，在一定條件下能形成水凝膠，此外還可對四臂聚乙二醇(4arm-PEG)進(jìn)行進(jìn)一步的化學(xué)修飾，從而構(gòu)成性能更優(yōu)的水凝膠。Collin等[62]設(shè)計了一種由四臂-琥珀酰亞胺基戊二酸酯醚-聚乙二醇(4S-StarPEG)交聯(lián)的Ⅱ型去端肽膠原蛋白/透明質(zhì)酸的可注射水凝膠，用于封裝NPCs和ADSCs，在37 ℃下約8 min可以發(fā)生凝膠化，該水凝膠系統(tǒng)在培養(yǎng)基中保持形狀穩(wěn)定并且具有支持細(xì)胞生長的能力。因牙髓干細(xì)胞(DPSCs)可以分化成軟骨細(xì)胞，Yao等[63]使用Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白和4S-StarPEG交聯(lián)形成水凝膠，包封在Ⅰ型和Ⅱ型膠原水凝膠中的DPSCs和DPSCs衍生的軟骨細(xì)胞在水凝膠中仍保持較高的活動性，可以移植到退化的椎間盤中以修復(fù)受損組織。Amer等[64]用降冰片烯修飾4arm-PEG，這種PEG可以與雙半胱氨酸交聯(lián)劑(CVPLSLYSGC)在紫外光照射下發(fā)生交聯(lián)。他們將其和人ESCs衍生的胰腺祖細(xì)胞包埋進(jìn)大鼠尾Ⅰ型膠原蛋白，37 ℃下UV照射6 min發(fā)生凝膠化，這種水凝膠可以維持細(xì)胞活性并誘導(dǎo)細(xì)胞向胰腺分化。Chen等[65]將雙鍵修飾的結(jié)冷膠和Ⅰ型膠原與干細(xì)胞混合，構(gòu)建負(fù)載干細(xì)胞的水凝膠，通過光/離子雙重交聯(lián)可以顯著提高水凝膠的固化速度以及機(jī)械性能，并用于血管形成研究(見圖2)。

圖2 包封BMSCs的膠原蛋白/結(jié)冷膠水凝膠的制備[65]Fig.2 Preparation of BMSCs-encapsulating methacrylated gellan gum/collagen hydrogel[65]

4.3.2 點(diǎn)擊化學(xué)致凝膠化

研究者還設(shè)計了多種生物相容的點(diǎn)擊反應(yīng)用于在基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞存在下直接形成水凝膠[66]，如炔烴和疊氮化物之間的Huisgen 1,3-偶極環(huán)加成，該反應(yīng)在銅(Ⅰ)催化下溫和且高效，在許多情況下既不需要保護(hù)基也不需要純化步驟。該反應(yīng)中的疊氮基和炔基與生物分子的反應(yīng)可忽略不計，在水性環(huán)境中具有良好的穩(wěn)定性，可用于靶向引導(dǎo)合成和基于活性的蛋白質(zhì)分析[67]。為了避免銅(Ⅰ)引入的細(xì)胞毒性，研究者們也開發(fā)了無銅(Ⅰ)催化的[3+2]疊氮-炔烴環(huán)加成法[68]、烯烴-硫醇產(chǎn)生穩(wěn)定硫醚鍵的點(diǎn)擊反應(yīng)、2-氰基苯并噻唑(CBT)與巰基點(diǎn)擊反應(yīng)[69]等，大大提高了生物3D打印應(yīng)用范圍。Xu等[70]開發(fā)了一種硫醇化的膠原與丙烯酸酯共聚物組成的可注射水凝膠，用于包封BMSCs，利用巰基與碳碳雙鍵的Michael加成反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)生理?xiàng)l件下(37 ℃、pH 7.4)的快速凝膠化，最快可在0.4 min內(nèi)成膠，儲能模量最大可達(dá)55.6 kPa。大鼠的心肌梗塞實(shí)驗(yàn)也證明，該水凝膠能對心臟的功能性再生有積極作用。Lee等[71]利用疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應(yīng)成功實(shí)現(xiàn)了將生長因子固定在膠原蛋白表面。利用這種思路可以把一些特異性基團(tuán)引入膠原分子，使膠原高效、定向發(fā)生凝膠化，這在干細(xì)胞3D打印中有廣泛的應(yīng)用前景。

4.3.3 酶促凝膠化

用酶和相應(yīng)底物反應(yīng)，使蛋白質(zhì)或多肽鏈發(fā)生共價交聯(lián)形成分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，比單純使用化學(xué)交聯(lián)劑要更加綠色，也減少了細(xì)胞毒性。Kuo等[72]從小鼠表皮提取膠原蛋白，對其進(jìn)行酪胺化修飾，并與內(nèi)皮集落形成細(xì)胞(ECFCs)、MSCs、過氧化氫和辣根過氧化氫酶共混，37 ℃下可以在10 min凝成膠原蛋白水凝膠。經(jīng)過模擬細(xì)胞外基質(zhì)條件和小鼠體內(nèi)條件培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，證明了可注射和酶促交聯(lián)的膠原-酚羥基水凝膠適用于支持人類祖細(xì)胞形成體外和體內(nèi)3D血管網(wǎng)絡(luò)。Mitra等[73]發(fā)現(xiàn)利用賴氨酰氧化酶介導(dǎo)膠原交聯(lián)可以調(diào)節(jié)膠原水凝膠的機(jī)械性能并調(diào)節(jié)MSCs向成骨分化的表型，能很好地改善成骨移植的特性。

4.3.4 醛基縮合致凝膠化

在一定的溫度下，有相互作用的基團(tuán)會發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而使分子交聯(lián)成凝膠網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)典的有羥醛縮合和醛醛縮合等。Wise等[74,75]用膠原蛋白/殼聚糖水凝膠封裝MSCs，利用β-磷酸甘油酯和乙二醛的交聯(lián)作用，在37 ℃下使用“油包水”的方法制造含有細(xì)胞的微珠。微珠水凝膠包封干細(xì)胞的形式為藥物遞送和組織修復(fù)提供了一定的方便性，在骨移植組織工程中有一定程度的應(yīng)用。Wang等[76]用水油乳化法制備殼聚糖/膠原蛋白復(fù)合微珠，簡而言之就是將殼聚糖、牛型Ⅰ型膠原蛋白、β-磷酸甘油酯、乙二醛和MSCs按照一定比例混合，在冰水浴中預(yù)冷，葉輪攪拌后獲得均勻的水油乳劑，再將溶液溫度提高到37 ℃，一段時間后形成凝膠。其中乙二醛和β-磷酸甘油酯作為物理和化學(xué)交聯(lián)劑，為基質(zhì)材料提供共聚合作用。Wang等[77]的另一篇文章指出，β-磷酸甘油酯引發(fā)的殼聚糖/膠原蛋白水凝膠比純膠原或純殼聚糖凝膠的機(jī)械性能更高，但β-磷酸甘油酯的存在會使人BMSCs的代謝活性降低。

5 結(jié) 語

傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)已經(jīng)無法滿足干細(xì)胞的發(fā)展需求，且存在很多缺陷，3D干細(xì)胞培養(yǎng)倍受重視和推廣。尤其是干細(xì)胞3D打印技術(shù)摒棄了傳統(tǒng)的批量化生產(chǎn)的模式，可以根據(jù)患者需求量體裁衣，制備個性化的植入物，從而實(shí)現(xiàn)對受損部位的修復(fù)，這些優(yōu)勢特點(diǎn)在組織器官重建領(lǐng)域的價值被寄予厚望。但是，由于干細(xì)胞3D打印的條件嚴(yán)格，要求材料兼顧細(xì)胞活性、無毒無害、快速凝膠等，適合的材料十分有限。

膠原蛋白作為細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，具有優(yōu)良的生物相容性、可降解性和弱抗原性等特征，用作干細(xì)胞3D打印材料有著巨大的優(yōu)勢。許多研究者通過物理、化學(xué)交聯(lián)復(fù)合其它材料等方法來制備膠原支架。物理凝膠方法不用添加額外的物質(zhì)，綠色環(huán)保。但物理凝膠法與大分子的自身性質(zhì)密切相關(guān)，可以實(shí)現(xiàn)溶液-凝膠的可逆變化，穩(wěn)定性不夠。與物理凝膠方法相比，化學(xué)凝膠法處理材料的交聯(lián)程度更高、時空精確度更高，能顯著提高膠原蛋白水凝膠的使用性能。但是化學(xué)交聯(lián)過程中可能會引入外源性物質(zhì)，這些物質(zhì)經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)或者細(xì)胞作用分解成其他小分子，致使材料具有細(xì)胞毒性，還需謹(jǐn)慎使用。

隨著干細(xì)胞3D打印技術(shù)的快速發(fā)展，解決干細(xì)胞3D打印生物材料問題是助力干細(xì)胞3D打印臨床應(yīng)用的關(guān)鍵，進(jìn)而為將來真正實(shí)現(xiàn)器官打印提供強(qiáng)有力的支持，為解決器官供體短缺問題開辟出新的路徑。