李丹娜,王麗瑩,牟曉鳳,劉 攀,柳亞男,李 濤,孫曉燕,王 軍,趙 烽

(1煙臺(tái)大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺(tái)大學(xué)),山東 煙臺(tái) 264005;2煙臺(tái)魯銀藥業(yè)有限公司,山東 煙臺(tái) 264000)

洋金花(Daturae Flos)為茄科植物白曼陀羅(DaturametelL.)的干燥花,在臨床上用于外科麻醉、銀屑病、癲癇、精神分裂癥、小兒肺炎、慢性支氣管炎等癥狀[1],分布在我國(guó)東北、華北、華東、中南及陜西、新疆、四川、貴州、云南地區(qū)．洋金桔的主要有效成分為莨菪烷類生物堿,其中東莨菪堿的含量約占85%,為含量最高的生物堿[2]．關(guān)于測(cè)定東莨菪堿含量的方法,文獻(xiàn)已報(bào)道的有中和滴定法[3]、薄層掃描法[4]、毛細(xì)管電泳法[5]及高效液相色譜法等[6-7]．PENG 等[8]從洋金花中通過微波輔助提取法(MAE)、浸漬提取法(SE)和回流提取法(BE)提取出來的東莨菪堿的含量分別為0.24%、0.24%和0.13%．付傳香等[9]對(duì)色譜柱、波長(zhǎng)、流速和流動(dòng)相進(jìn)行選擇,得到與SGE protecol C18(5 μm,4.6×100 mm)和SGE protecol C8(5 μm,4.6×250mm)相比,另一種傳統(tǒng)定量分析色譜柱SGE protocol C18(5 μm,4.6×250 mm)能更準(zhǔn)確地分離出東莨菪堿,且分離度大于1.5,為2.1;進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描時(shí),在216 nm處待測(cè)組分響應(yīng)值最大且分離度符合要求．研究并優(yōu)化從洋金花中提取東莨菪堿的方法,可為制備高純度東莨菪堿奠定研究基礎(chǔ)．

本文對(duì)高效液相色譜法測(cè)定東莨菪堿的含量進(jìn)行了方法學(xué)研究,對(duì)不同產(chǎn)地的洋金花進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),并分別采用常規(guī)酸水浸漬[10]、常規(guī)乙醇浸漬[11]、有機(jī)溶劑回流提取法[12]、超聲波輔助二氯甲烷提取法[13]對(duì)藥材進(jìn)行提取,HPLC法測(cè)定各提取物中東莨菪堿的含量,確定提取東莨菪堿的最佳方法．

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

Agilent 1100單元泵高效液相色譜儀,ODS-色譜柱(4.6×250 mm, 5 μm),安捷倫工作站,G1310A單元泵(DE23905769),G1314A檢測(cè)器(JP24021101);電子天平(BS224S型,上海亞津電子科技有限公司);超聲提取器(KQ-300DE型,昆山市超聲儀器有限公司);雙顯恒溫加熱磁力攪拌器(SH-3型,北京金紫光科技發(fā)展有限公司);pH計(jì)(PHS-3FA型,上海博取儀器有限責(zé)任公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA型,上海亞榮生化儀器廠);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Model型,湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)．

1.2 藥材與試劑

洋金花藥材產(chǎn)地分別為江蘇、廣東、四川、湖南、云南、河北、山東;氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品(純度≥98%)購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司;乙腈、甲醇(色譜純,德國(guó)Merck公司);磷酸鈉、十二烷基硫酸鈉、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醇、鹽酸、濃氨水均為分析純．

2 方 法

2.1 不同方法從洋金花藥材中提取東莨菪堿

2.1.1 酸水浸漬法(藥典記載方法) 取洋金花藥材粉碎,過三號(hào)篩(50目),取該藥材過篩粉末1 g,用10 mL的2 mol/L 鹽酸溶解,超聲振蕩(功率250 W,頻率40 kHz,提取30 min)放至室溫,用2 mol/L鹽酸溶液10 mL分?jǐn)?shù)次洗滌錐形瓶和濾餅,合并濾液和洗滌液,得供試品Ⅰ．

2.1.2 乙醇浸漬法 取洋金花粉末100 g,用75 %的乙醇1 400 mL浸漬2次,每次75 h,濾過,回收乙醇,得浸膏,真空低溫(t=45 ℃) 干燥至恒定質(zhì)量, 精密稱定為21.04 g．取浸膏0.210 g,加蒸餾水10 mL,調(diào)pH值為2～3,溶解、濾過,得供試品Ⅱ．

2.1.3 超聲波輔助二氯甲烷提取 取洋金花藥材粉碎,過三號(hào)篩(50目),取該藥材過篩粉末1 g,加氨水2 mL,二氯甲烷10 mL,超聲處理30 min,濾過,蒸干,用三氯甲烷復(fù)溶,加水10 mL,調(diào)pH值為2～3,反復(fù)萃取2次,合并酸水相,得供試品Ⅲ．

2.1.4 有機(jī)溶劑回流提取法 取洋金花粉末100 g,用75% 的乙醇回流2次,每次加700 mL溶劑,第一次回流2 h,第二次回流1.5 h,合并提取液,濃縮得浸膏,真空低溫(t=45 ℃) 干燥至恒定質(zhì)量,精密稱定為25.68 g．取浸膏0.257 g,加水10 mL,調(diào)pH值為2～3,溶解、過濾,得供試品Ⅳ．

2.2 溶液配制

2.2.1 氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品溶液的配制 精密稱定氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品5.54 mg,置于10 mL容量瓶中,加流動(dòng)相溶解,并定容至刻度,即得0.554 mg/mL對(duì)照品溶液．

2.2.2 供試品溶液的配制 分別取供試品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,用濃氨水調(diào)節(jié)pH值到9.0左右,然后用40 mL的三氯甲烷分4次萃取,合并萃取液,置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收三氯甲烷,殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解,轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中,加流動(dòng)相至刻度,搖勻,用0.22 μm的濾膜過濾,取濾液為供試品溶液．

2.3 色譜條件[10]

流動(dòng)相為0.07 mol/L磷酸鈉溶液-乙腈(100∶50);檢測(cè)波長(zhǎng)為216 nm;流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為20 μL;理論塔板數(shù)按東莨菪堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000．在上述色譜條件下,待測(cè)組分可以和其他組分達(dá)到基線分離,保留時(shí)間約為11.0 min．

3 結(jié)果與分析

3.1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)

精密稱取氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品28.90 mg,置于50 mL容量瓶中加入流動(dòng)相定容至刻度,搖勻．分別精密吸取3、5、7、9、10 mL,置于10 mL容量瓶中,加入流動(dòng)相定容至刻度,搖勻,即得．在上述色譜條件下,分別精密吸取20 μL注入到色譜儀中,測(cè)定峰面積積分值,用對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量作為橫坐標(biāo),峰面積積分值作為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:Y=981.67X+992.86(r=0.998 9)．

結(jié)果表明,氫溴酸東莨菪堿在1.2～4 μg范圍內(nèi),峰面積積分值與進(jìn)樣量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系．

3.2 精密度考察

在上述色譜條件下,精密吸取“2.2.1”中對(duì)照品溶液20 μL,重復(fù)進(jìn)樣5次,測(cè)定其峰面積值．結(jié)果RSD=0.91 %,由此表明,本法有較好的精密度．

3.3 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液,配制后,分別于0、2、4、6、8、12、24、48、72 h進(jìn)樣,依法測(cè)定其峰面積,測(cè)定結(jié)果無顯著變化,RSD=1.44 %,表明供試品在72 h內(nèi)基本穩(wěn)定．

3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一個(gè)來源地的洋金花藥材,按照“2.1.1”方法操作,平行5份,在上述色譜條件下測(cè)定峰面積,考察方法的重現(xiàn)性,結(jié)果RSD=1.16 %,表明此方法具有良好的重現(xiàn)性．

3.5 酸水浸漬法測(cè)定不同產(chǎn)地洋金花中東莨菪堿

的含量

取江蘇、湖南、云南、廣東、四川、河北、山東7個(gè)不同產(chǎn)地的洋金花,按照“2.2.2”方法制備供試品溶液,在上述色譜條件下測(cè)定峰面積,并計(jì)算東莨菪堿的含量,結(jié)果如表1．

3.6 加樣回收率試驗(yàn)

取同一產(chǎn)地已知東莨菪堿含量的洋金花藥材約0.5 g各5份,精密稱定,分別加入“2.2.1”對(duì)照品溶液(東莨菪堿相當(dāng)于0.4 mg/mL)各2.0 mL,按照供試品溶液的配制方法平行配制,在上述色譜條件下進(jìn)樣20 μL,進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算加樣回收率(表2),得到平均回收率為98.92%．

表1 不同產(chǎn)地洋金花中東莨菪堿的含量測(cè)定(n=3)

Tab.1 Determination of scopolamine content in Daturae Flos from different areas(n=3) %

表2 加樣回收率(n=5)

3.7 對(duì)不同提取方法提取效果的考察

不同產(chǎn)地洋金花中東莨菪堿的含量測(cè)定結(jié)果表明,四川產(chǎn)地藥材中東莨菪堿的含量符合藥典標(biāo)準(zhǔn)且易購(gòu)買,因此選取四川產(chǎn)地的洋金花藥材,按上述供試品溶液的制備方法,制備供試品溶液,在上述色譜條件下測(cè)定峰面積,并計(jì)算東莨菪堿的含量,結(jié)果如表3．

表3 不同提取方法對(duì)東莨菪堿提取效率的影響(n=3)

Tab.3 Effect of different methods on the extraction efficacy(n=3) %

4 討 論

由于藥材來源受限,本研究?jī)H測(cè)定了7個(gè)不同產(chǎn)地洋金花藥材中東莨菪堿的含量,對(duì)藥材進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同產(chǎn)地洋金花中東莨菪堿的含量高低為:江蘇>湖南>云南>廣東>四川>河北>山東,高含量約為低含量的3倍左右,說明洋金花藥材中東莨菪堿的含量易受地域環(huán)境的影響．2015版藥典規(guī)定,洋金花中東莨菪堿的含量應(yīng)高于0.15%．本研究測(cè)定的7個(gè)產(chǎn)地的洋金花藥材中,有5個(gè)產(chǎn)地的符合藥典要求,但是河北與山東產(chǎn)地的洋金花藥材中東莨菪堿的含量未達(dá)到藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn),更多產(chǎn)地洋金花藥材中東莨菪堿的含量還有待于進(jìn)一步測(cè)定,并且尚未進(jìn)行花中與其他部位中東莨菪堿含量的橫向比較．鑒于不同產(chǎn)地洋金花藥材中東莨菪堿的含量參差不齊,在臨床應(yīng)用過程中,要格外注意洋金花的質(zhì)量控制,防止中毒事件的發(fā)生．

通過文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn),藥典所記載酸水浸漬法未必即是從洋金花中提取東莨菪堿的最佳方法,有機(jī)溶劑浸漬、回流等方法[9-10]提取東莨菪堿的效率均有可能優(yōu)于酸水浸漬法．本研究通過對(duì)4種提取方法進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)在東莨菪堿的提取效率上,乙醇回流提取法>超聲波輔助二氯甲烷提取法>常規(guī)乙醇浸漬法>常規(guī)酸水浸漬法．乙醇回流提取法的提取效率最高,可以達(dá)到常規(guī)酸水提取法的2倍．提示在洋金花藥材中東莨菪堿含量受限的情況下,可以通過采用有機(jī)溶劑回流法提取洋金花中的東莨菪堿,從而提高收率,降低成本,并且乙醇回流提取法也適用于工業(yè)化生產(chǎn)．

綜上,本文對(duì)HPLC法測(cè)定洋金花藥材中東莨菪堿的含量進(jìn)行了方法學(xué)研究,結(jié)果表明方法簡(jiǎn)便可行,準(zhǔn)確度高,可廣泛用于洋金花藥材的質(zhì)量控制．有機(jī)溶劑回流法可用于建立經(jīng)濟(jì)、合理、可控的東莨菪堿的工業(yè)化提取工藝．