安 紅,劉萬卉,,沈振鐸,沙春潔,楊博璐,趙燕燕,

(1.煙臺大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 煙臺 264005;2山東綠葉生命科學(xué)集團(tuán)長效靶向藥物傳遞系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 煙臺 264005;3.山東綠葉生命科學(xué)集團(tuán)博安生物技術(shù)有限公司,山東 煙臺 264005;4.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院,中國 南京 211100)

在過去的幾十年中,抗體類藥物,包括Fc融合蛋白,在臨床惡性腫瘤、自身免疫病、感染、心血管疾病和器官移植等重大疾病的治療中取得了快速發(fā)展．截至2016年3月,已有超過60個(gè)抗體類藥物經(jīng)美國食品藥品管理局 (FDA) 批準(zhǔn)上市,其中有9個(gè)是Fc融合蛋白藥物[1]．

阿柏西普 (Aflibercept) 是一種全人源化的重組Fc融合蛋白,使用基因工程技術(shù)將血管內(nèi)皮生長因子受體 (VEGFR)-1的第2結(jié)構(gòu)域和VEGFR-2的第3結(jié)構(gòu)域與人IgG1的恒定區(qū)融合而產(chǎn)生[2-3],因此對VEGF-A,VEGF-B和胎盤生長因子的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于第一代抗VEGF藥物,從而有效地發(fā)揮抗血管生成作用[4]．2011年,阿柏西普在美國上市,目前在FDA已獲批了4個(gè)適應(yīng)證,包括視網(wǎng)膜靜脈阻塞繼發(fā)黃斑水腫、濕性年齡相關(guān)性黃斑變性、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞繼發(fā)黃斑水腫和糖尿病性黃斑水腫[5]．

本實(shí)驗(yàn)室開展了阿柏西普類似藥的開發(fā)研究,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過proteinA柱純化后的蛋白具有較寬的等電點(diǎn) (pI) 范圍,為6.7～9.2,而阿柏西普的pI范圍為6.7～8.1,即存在多種電荷異構(gòu)體．已知電荷異構(gòu)體作為一種關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQA),可能潛在的影響藥代動力學(xué) (PK) 特性以至于影響藥物的安全性和有效性[6-8]．因此,把經(jīng)過protein A柱純化后的蛋白作為起始材料,制備得到3個(gè)具有不同pI范圍的電荷異構(gòu)體組分,按pI值從低到高分別為Fr 1、Fr 2和Fr 3;采用成像毛細(xì)管等電聚焦電泳 (iCIEF)、分子排阻色譜 (SEC) 和肽圖分析對3個(gè)電荷異構(gòu)體組分進(jìn)行表征,并檢測其寡糖和唾液酸含量．單次靜脈給藥SD雄性大鼠進(jìn)行PK研究,通過與阿柏西普進(jìn)行對照,觀察不同電荷異構(gòu)體的PK性質(zhì),并初步揭示了機(jī)理．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

使用弱陽離子交換色譜法,將經(jīng)過protein A柱純化阿柏西普類似藥細(xì)胞收獲液得到的蛋白作為起始材料,pI范圍為6.7 ～ 9.2,分離制備得到3個(gè)pI不同的電荷異構(gòu)體組分,按pI值從低到高分別命名為Fr 1、Fr 2和Fr 3; 阿柏西普購自SANOFI.

1.2 儀器

405LS洗板機(jī)購自BIO-TEK公司;Infinite F50酶標(biāo)儀購自TECAN公司;PHMP-4孵化箱購自三洋公司;Heraeus Multifuge XIR 離心機(jī)和Fresco21微量臺式離心機(jī)均購自Thermo Fisher公司;Advantage A10 Milli-Q超純水制備儀購自Millpore公司

1.3 試劑

PBST pH值7.4、PBS pH值7.4、牛血清白蛋白 (BSA) 購自Sigma;TMB microwell peroxidase substrate、過氧化物酶底物B、TMB過氧化物酶底物均購自KPL;捕獲抗原rhVEGF購自RD;二抗Anti-Human IgG購自Sigma;85% 磷酸購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司.

1.4 實(shí)驗(yàn)動物

健康成年的清潔級SD大鼠,16只,雄性,年齡8周,體重約250 ± 10 g,由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供．

1.5 動物試驗(yàn)

將SD大鼠隨機(jī)分為4組,Fr 1、Fr 2、Fr 3和阿柏西普組,給藥劑量10 mg/kg,給藥體積0.4 mL/kg,尾靜脈注射．

給藥前禁食12 h,自由飲水,給藥后3 h,統(tǒng)一進(jìn)食,進(jìn)食時(shí)間分別在首次給藥前 (0) 及給藥后5 min、30 min、6 h、24 h、2 d、3 d、7 d、10 d、14 d、17 d、21 d、24 d、28 d、35 d、42 d．

從大鼠的眼眶靜脈叢采血略大約0.35 mL,血液置于預(yù)冷的肝素化的抗吸附離心管中,混勻后,4 ℃,3 000×g離心5 min后,取上清液至另一抗吸附離心管中,-70 ℃保存待測．為避免時(shí)間影響,除第一天外,其他采樣時(shí)間為早上9：00左右．

本實(shí)驗(yàn)有關(guān)動物實(shí)驗(yàn)方案已獲得煙臺大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)．

1.6 血漿藥物濃度的測定

首先,將0.2 μg/mL抗原加入到96孔聚苯乙烯微量滴定板中,100 μL/孔,4 ℃過夜．用PBST 300 μL/孔洗滌4次．然后加入1% BSA/PBS,200 μL/孔,37 ℃孵育1 h．加入空白、標(biāo)液、質(zhì)控(QC) 樣品和血漿樣品(復(fù)孔),100 μL/孔,37 ℃,1 h．再用PBST 300 μL/孔洗滌4次．加入1∶5 000稀釋的猴血漿吸附的羊抗人-HRP二抗100 μL/孔,37 ℃孵育1 h,隨后進(jìn)行另一次洗滌．然后,將100 μL 四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 過氧化物酶底物 [Kirkegaard&Perry Labs (KPL) 50-76-0]和過氧化物酶溶液B,0.02%過氧化氫 (KPL 50-65-00) 的1∶1混合物添加到每個(gè)孔中．溫育30 min后,加入100 μL 1 mol/L磷酸終止反應(yīng),顏色由藍(lán)綠色變?yōu)辄S色．使用酶標(biāo)儀在可見光 450 nm和630 nm處讀數(shù)．采用四參數(shù)擬合分析數(shù)據(jù)．

2 結(jié)果和討論

Fr 1—Fr 3的iCIEF、SEC和唾液酸分析結(jié)果如表1所示,測得Fr 1—Fr 3的pI范圍分別為6.7～7.7、7.3～8.4和7.5～9.2;且pI> 8.14的堿性電荷異構(gòu)體含量逐漸增加;單體百分比分別為98.7%、98.8%和96.5%,表明Fr 1—Fr 3均具有相對較高的單體純度．從Fr 1到Fr 3,唾液酸Neu5Ac的物質(zhì)的量的比顯著降低,可能是由于損失了含唾液酸Neu5Ac的糖鏈造成的．因此,推測從Fr 1到Fr 3,pI升高可能與唾液酸Neu5Ac的含量依次降低也有關(guān)．同樣未觀察到唾液酸Neu5Gc,表明不存在潛在的免疫原性．

表1 Fr 1—Fr 3的iCIEF、SEC和唾液酸分析結(jié)果

肽圖分析的結(jié)果如表2所示,Fr 1—Fr 3均含有5種翻譯后修飾 (PTMs),分別為C-末端賴氨酸 (CTL)、甲硫氨酸氧化、天冬酰胺脫酰胺、天冬氨酸異構(gòu)化和去糖基化．且CTL的比例從50.5%依次增加至66.2%;5個(gè)糖基化位點(diǎn)的去糖基化比例依次變大(N36,從0.1%～0.3%;N68,從23.7%～41.7%;N123,從0.1%～0.5%;N196,從0.9%～11.3%;N282,從0.5%～6.4%)．甲硫氨酸氧化、天冬酰胺脫酰胺和天冬氨酸異構(gòu)化在各組分之間沒有顯著變化．這些結(jié)果表明,從Fr 1到Fr 3,pI升高可能是由于CTL含量和去糖基化比例顯著增加造成的．

表2 Fr 1—Fr 3的肽圖分析結(jié)果

寡糖分析的結(jié)果見表3,表明:Fr 1—Fr 3均含有14種糖型,沒有檢測到含潛在免疫原性的糖型,如Neu5Gc、Gal-α-1和3Gal．糖型Man5的含量有輕微升高趨勢 (從8.6%～24.8%),但其作為中性糖不影響pI值．其他糖型的含量在各個(gè)組分間沒有顯著性差異．

使用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 測定單次靜脈給予Fr 1、Fr 2、Fr 3和阿柏西普至SD雄性大鼠后的血漿藥物濃度．方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明:該方法具有較高的特異性;且在0.469～30 ng/mL范圍內(nèi)線性良好,其中r為0.999;回收率、日內(nèi)精密度和日間精密度范圍分別為86.4%～113.2%、2.1%～7.9%和4.3%～10.6%．以上數(shù)據(jù)均符合方法學(xué)驗(yàn)證的要求．

表3 Fr 1—Fr 3的寡糖分析結(jié)果

Fr 1—Fr 3和阿柏西普的血漿藥物濃度-時(shí)間曲線如圖1所示． 使用Phoenix WinNonlin 6.3 非房室分析 (NCA) 計(jì)算藥代動力學(xué)參數(shù)．其中,關(guān)鍵藥代動力學(xué)參數(shù)包括濃度曲線下面積(AUC0-t)、清除率 (CL)、半衰期 (t1/2),結(jié)果如表4所示．阿柏西普的AUC0-42d為231 ± 43(μg/mL)·d,t1/2為4.14 ± 2.0 d,CL為44.3 ± 7.2 mL/d/kg．與阿柏西普相比,Fr 1的AUC0-42d,t1/2和CL值沒有顯著差異,因此可以看作是阿柏西普的類似物;Fr 2的AUC0-42d降低到17.1 ± 4.5(μg/mL)·d,t1/2降低到3.43 ± 1.8 d,CL升高到618 ± 161 mL/d/kg;Fr 3的AUC0-42d降低到2.49 ± 0.55(μg/mL)·d,t1/2降低到0.365 ± 0.066 d,CL升高到4 125 ± 880 mL/d/kg．表明:從Fr 1到Fr 3,組分的AUC0-42d和t1/2逐漸降低,CL逐漸升高,即PK特性逐漸變差．

圖1 Fr 1—Fr 3和阿柏西普的血漿藥物濃度-時(shí)間曲線(mean ± SD,n=4)

Fig.1 Plasma concentration-time profiles of Fr 1-Fr 3 and Aflibercept (mean±SD,n=4)

表4 Fr 1—Fr 3和阿柏西普的關(guān)鍵血漿PK參數(shù) (mean ± SD, n=4)

基于上述結(jié)果,Fr 1—Fr 3的主要差異包括CTL、Man5和唾液酸Neu5Ac含量的差異,如表5所示．從Fr 1到Fr 3,雖然Man5含量有升高趨勢,但其作為中性糖不影響pI．且研究表明,Man5可能會增加單克隆抗體的CL[9],但不是影響Fc融合蛋白PK性質(zhì)的關(guān)鍵糖基化模式[10-12]．肽圖分析和唾液酸分析的結(jié)果表明，從Fr 1到Fr 3,pI升高可能是由于CTL含量逐漸升高和唾液酸Neu5Ac含量依次降低造成的．然而,文獻(xiàn)報(bào)道,CTL通過血液中羧肽酶的內(nèi)源性循環(huán)從注射的抗體中快速去除,因此對產(chǎn)品的安全性和有效性影響極小[13]．另有研究表明,唾液酸Neu5Ac對降低Fc融合蛋白的CL至關(guān)重要,主要作用機(jī)制是通過掩蓋半乳糖 (Gal) 以防止相關(guān)蛋白被肝臟中的去唾液酸糖蛋白受體 (ASGPR) 識別并移除[14-15]．因此,推測從Fr 1到Fr 3,組分的AUC0-t和t1/2逐漸降低,CL逐漸升高,可能是由于唾液酸Neu5Ac含量降低造成的．

表5 Fr 1—Fr 3的主要差異比較

3 結(jié) 論

研究結(jié)果表明,從Fr 1到Fr 3,pI升高可能是CTL含量逐漸升高和唾液酸Neu5Ac含量依次降低的結(jié)果;組分的AUC0-t和t1/2逐漸降低,CL逐漸增加,推測可能是由于唾液酸Neu5Ac的含量降低造成的．因此,在阿柏西普類似藥的研制過程中,為了確保產(chǎn)品的安全性和有效性,建議要控制唾液酸Neu5Ac的含量．