馬曉輝， 晉 玲，3?， 朱田田， 何微微， 黃得棟

［1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中（藏） 藥資源研究所，甘肅 蘭州730000；3.甘肅省高校中（藏） 藥化學(xué)質(zhì)量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州730000］

中麻黃Ephedra intermedia Schrenk ex Mey. 為麻黃科麻黃屬植物［1］。始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，具有發(fā)汗散寒、宣肺平喘、利水消腫的功效［2］。中麻黃含有多種藥效成分，主要有麻黃堿、偽麻黃堿和甲基麻黃堿等［3］。2015 年版《中國藥典》 規(guī)定藥用麻黃以麻黃堿和偽麻黃堿的總量在0.8%以上為符合藥用標(biāo)準(zhǔn)［4］。近年來，由于濫采濫挖致使中麻黃野生資源嚴(yán)重破壞，已被列為瀕危藥用植物。因此在研究合理保護(hù)的同時，科學(xué)的采收不僅保證藥用來源，同時對其保護(hù)也有積極意義［5-6］。雖然目前采用HPLC 法測定制劑和藥材中的麻黃堿與偽麻黃堿含有量的方法較多，但運用HPLC 法測定中麻黃不同采收期藥效成分動態(tài)變化研究尚未報道［7-15］。因而本研究采用HPLC法對甘肅蘭州仁壽山及榆中興隆山所產(chǎn)半野生中麻黃中的麻黃堿、偽麻黃堿以及甲基麻黃堿的變化規(guī)律進(jìn)行研究，以期為確定中麻黃的最佳采收期提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters 1525 高效液相色譜儀（二元泵，二極管陣列檢測器，美國Waters 公司）；AE-163 分析天平（瑞士梅特勒公司）；BX7200HP 超聲波清洗器（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；LG-500A 高速萬能粉碎機(jī) （瑞安市百信藥機(jī)器廠）；加熱鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

1.2 試劑 麻黃堿（批號171241-201508）、偽麻黃堿（批號171237-201208）、甲基麻黃堿（批號171247-200301） 對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；三乙胺（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；二正丁胺（分析純，天津市豐越化學(xué)品有限公司）；磷酸（色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；甲醇為色譜純；水為超純水。

2 樣品信息及采樣原則

2.1 樣品信息 中麻黃藥材共22 個樣品，采集于甘肅省蘭州市仁壽山和榆中縣興隆山，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)晉玲教授鑒定為正品。見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2.2 采樣原則 在仁壽山及興隆山各選取2 個野生中麻黃植物居落，每個居落選定較分散的植株設(shè)定2 個樣方套（10×10），每個樣方套按等距法各取5株無病害的中麻黃植株，掛牌并標(biāo)記，每隔約15 d每株剪取約20 g 草質(zhì)莖，分裝標(biāo)記，帶回分子實驗室，并及時干燥處理。樣方套設(shè)置見圖1～2。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件 Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，10 μm）； 流動相甲醇-0.092%磷酸溶液 （含有0.04%三乙胺及0.02%二正丁胺）； 體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長210 nm；進(jìn)樣量10 μm。

圖1 樣方套Fig.1 Sample set

圖2 等距法設(shè)置樣方套Fig.2 Isometric method set sample square

3.2 色譜系統(tǒng)適用性 在“3.1” 項條件下檢測，麻黃堿保留時間11.371 min、偽麻黃堿保留時間13.229 min、甲基麻黃堿保留時間15.827 min。色譜圖見圖3。

圖3 各成分HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

3.3 對照品溶液制備 稱取各對照品粉末適量，精密稱定，加甲醇使溶解制成混合對照品貯備液，其中麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿質(zhì)量濃度分別為519、447、16 μg／mL。

3.4 供試品溶液制備 取中麻黃干燥草質(zhì)莖，粉碎，取過6 號篩的細(xì)粉0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液50 mL，稱定質(zhì)量，進(jìn)行超聲處理（功率600 W，頻率60 Hz）35 min，靜置至室溫，再稱定質(zhì)量，用1.44%磷酸溶液補足減失質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜進(jìn)行過濾，取續(xù)濾液，即得。

4 方法學(xué)驗證

4.1 線性關(guān)系考察 取各對照品適量，精密稱定，加1.44%磷酸試液制成每1 mL 含麻黃堿519 g、偽麻黃堿447 g、甲基麻黃堿16 g 的溶液，作為對照品貯備液。依次從中精密吸取0.5 mL 置于5 mL 量瓶，用1.44%磷酸試液連續(xù)稀釋5 次，精密吸取對照品貯備液和稀釋液各10 μL，在“3.1” 項條件下測定峰面積，以進(jìn)樣濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)（X），峰面積的對數(shù)值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

4.2 精密度試驗 精密吸取同一份供試品溶液10 L，在“3.1”項條件下，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿峰面積的RSD 分別為3.2%、2.9%、1.4%，表明該儀器精密度良好。

4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品藥材粉末0.5 g，精密稱定，按“3.4” 項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，分別于0、2、4、6、8、10 h 進(jìn)樣，測得麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿峰面積的RSD 分別為1.2%、0.4%、0.1% （n=6），表明供試品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.4 重復(fù)性試驗 取同批供試品藥材粉末品6 份，每份取約0.5 g，精密稱定后，按“3.4” 項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，在“3.1”項條件下進(jìn)樣，測得麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿平均含有量分別為0.08%、0.85%、0.004%，RSD 分別為1.03%、0.42%、0.09%，表明該方法重復(fù)性良好。

4.5 加樣回收率試驗 取已知含有量的同一批9份，每份約1.5 g，精密稱定，每3 份作為一個濃度水平，分別精密加入中麻黃對照品溶液， 按“3.4” 項下方法制備供試品溶液，在“3.1” 項條件下進(jìn)樣，計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=9）

5結(jié)果與分析

不同生長期中麻黃草質(zhì)莖中麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿的含有量見表4?？芍?，在2 個產(chǎn)地的不同生長期，麻黃堿的含有量均明顯低于偽麻黃堿，而甲基麻黃堿的含有量則很低。 《中國藥典》 規(guī)定麻黃藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以麻黃堿和偽麻黃堿的總量不低于0.8%。比較同一產(chǎn)地不同生長期中指標(biāo)成分（麻黃堿和偽麻黃堿） 總含有量，結(jié)果顯示，2 個產(chǎn)地6 月中旬至7 月底采收的中麻黃中指標(biāo)成分總含有量均低于《中國藥典》 規(guī)定的最低含有量，即該時期采收的中麻黃作麻黃使用均不合格。對各生長期中麻黃堿和偽麻黃堿的總含有量變化見圖4?？芍?，各生長期中麻黃中指標(biāo)成分總含有量變化波動較大，6 月至7 月中旬呈逐漸降低趨勢，7 月中旬呈現(xiàn)含有量最低，自7 月中旬之后含有量逐漸增加，10 月中旬達(dá)最高。

6 討論

圖4 各樣品中指標(biāo)成分總含有量變化趨勢Fig.4 Variation trend of the total contents of index components of various samples

仁壽山及興隆山各生長期中麻黃中偽麻黃堿含有量近為麻黃堿含有量的10 倍，且二者含有量變化基本呈正相關(guān)，可能原因為中麻黃中的生物堿為麻黃堿和偽麻黃堿，二者均具有揮發(fā)性，互為立體異構(gòu)體共同存在，但偽麻黃堿結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，因此在干燥藥材中偽麻黃堿的含有量一般高于麻黃堿。相比較而言，甲基麻黃堿的含有量甚微，不可用于分析，中麻黃的質(zhì)量可以麻黃堿和鹽酸為麻黃堿為評價指標(biāo)。

中麻黃仁壽山產(chǎn)地有人工灌溉管道，會定期進(jìn)行灌溉，而興隆山產(chǎn)地則完全處于野生狀態(tài)，無人為因素介入。但2 個產(chǎn)地中麻黃中指標(biāo)成分的含有量均在6 月上旬、9 月中旬及10 月中旬相對較高，其可能原因為6 月下旬至7 月底為多年生中麻黃營養(yǎng)旺盛生長期，抑制了次生代謝產(chǎn)物的積累，8 月份后營養(yǎng)生長逐漸減慢，次生代謝產(chǎn)物積累開始增加，10 月中旬達(dá)到最大積累量，11 月西北地區(qū)天氣轉(zhuǎn)冷，出現(xiàn)霜降等天氣，中麻黃植物逐漸枯死，生物量減少。藥材采收期應(yīng)綜合考慮有效成分含有量與產(chǎn)量確定，故中麻黃在10 月到11 月左右采收為佳，此時有效成分含有量最高，生物量還未枯死，產(chǎn)量相對較高。所得結(jié)果與《甘肅中草藥資源志》 （下冊）記載及當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)認(rèn)為采收時間為立秋之后基本吻合。

表4 各成分含有量測定結(jié)果（%）Tab.4 Results of content determination of various constituents（%）

影響中麻黃生長及次生代謝產(chǎn)物積累的因素包括遺傳及生態(tài)環(huán)境［16-18］，本研究就不同產(chǎn)地不同生長期中麻黃指標(biāo)成分含有量進(jìn)行研究，結(jié)果顯示6 月中旬至7 月中旬采中麻黃藥效成分總含有量呈下降趨勢，7 月中旬后逐步升高，至10 月中旬達(dá)到最大值，考慮11 月后氣候?qū)Ξa(chǎn)量的影響，按《中國藥典》 對指標(biāo)性成分的要求，并結(jié)合課題組前期人工更新試驗研究栽培中麻黃認(rèn)為在保障水肥條件下，考慮刈割后生物量恢復(fù)等因素，興隆山及仁壽山產(chǎn)中麻黃可1 年采收2 次，分別為6 月上旬和10 月中旬。