李存玉， 李賀敏， 支興蕾， 劉莉成， 李紅陽， 彭國平?

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023；2.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210023）

以乙醇為代表的有機溶劑在中藥制藥領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛，但衍生出的提取物、萃取物、洗脫部位在進行精制純化時，高溫處理所帶來的成分轉(zhuǎn)化會嚴重影響目標產(chǎn)物質(zhì)量，同時因回收溶劑比例變化而難以循環(huán)利用， 造成資源浪費、 環(huán)境污染［1］。1993 年高從堦院士首次提出常溫化精制的納濾分離技術(shù)［2］，其截留分子量在100 ～1 000 Da 之間，分離特點與超濾、微濾有所不同，因其膜材質(zhì)表面的荷電性，分離過程為電荷、位阻、溶解-擴散效應(yīng)等多種效應(yīng)綜合的結(jié)果［3-4］，但針對有機溶液環(huán)境下中藥成分的納濾精制研究尚處于探索階段［5］。

水蘇堿是益母草中主要藥效成分［6］，在光照和長時間加熱下均會降解，影響制劑質(zhì)量的同時也造成藥用資源的浪費，在對其進行色譜分離時制得以乙醇為洗脫液的中間體，大多采取低溫減壓回收來控制成分的降解，但生產(chǎn)效率偏低。本實驗探索納濾技術(shù)對乙醇中水蘇堿富集的適用性，并結(jié)合膜面溶脹特征闡明該成分的分離規(guī)律，為明確有機溶液環(huán)境下納濾分離機制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥 復(fù)合聚酰胺納濾膜（孔徑150、475、800 Da，南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司）。鹽酸水蘇堿對照品（批號110773-201313，中國食品藥品檢定研究院）。益母草提取物（自制，益母草飲片加水提取后色譜分離制備得到， 水蘇堿含有量＞70%）。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 TNZ-1 型納濾分離設(shè)備（南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司）；e2695 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；ELSD 6000 檢測器（美國Alltech 公司）；MS105 電子天平［十萬分之一，梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取鹽酸水蘇堿對照品3.60 mg，置于5 mL 量瓶中，流動相超聲溶解，定容至刻度，即得（每1 mL 含0.72 mg 該成分）。

2.1.2 供試品溶液 益母草提取物用不同體積分數(shù)乙醇配制成5.0%、17.5%、30.0%，其中鹽酸水蘇堿質(zhì)量濃度為105.0 μg／mL。

2.2 納濾分離 采用前期建立的方法［7］，按照圖1 組裝納濾膜、中壓泵等納濾裝置，設(shè)置操作壓力為1.0 MPa。將納濾膜置于分離系統(tǒng)中，納濾分離初始階段需要藥液在納濾膜中循環(huán)平衡，排除因膜材質(zhì)對成分吸附的干擾，待鹽酸水蘇堿與膜組件之間的吸附、解吸附達到平衡時，從儲液罐中取樣平衡液，進而開始納濾，納濾液罐收集納濾液，待樣品納濾分離至無法維持系統(tǒng)分離時，關(guān)閉納濾系統(tǒng)，納濾液中取樣納濾液。

圖1 納濾分離設(shè)備Fig.1 Nanofiltration separation equipment

2.3 鹽酸水蘇堿含有量測定

2.3.1 色譜條件［8］Waters Xbridge Hilic 色譜柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流動相乙腈-0.2%冰醋酸（80 ∶20）。蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)為漂移管溫度80 ℃，氣體體積流量2.0 L／min；體積流量0.8 mL／min。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液1、2、5、10、20 μL，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定。以峰面積（Y）、進樣量（X） 取對數(shù)進行回歸，得方程為Y=0.56X+4.60（R2=0.999 5），在0.72～14.4 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 截留率計算 取納濾分離制備的納濾液（C1） 及平衡液（C2），測定峰面積并取對數(shù)后代入“2.3.2” 項下回歸方程，計算鹽酸水蘇堿含有量，按照式（1） 計算截留率（R）。

2.5 水蘇堿分離數(shù)據(jù)積累 應(yīng)用Design-Expert 8.06軟件［9］，考察乙醇體積分數(shù)（A）、pH 值（B）、膜孔徑（C） 對鹽酸水蘇堿納濾分離行為的影響，以截留率（Y）為評價指標。因素水平見表1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.6 納濾分離層溶脹分析 為了排除膜污染帶來的干擾，在操作壓力1.0 MPa 條件下分別選擇空白水溶液及5%、7.5%、30%乙醇，考察膜面因溶脹帶來的通量衰減變化，見式（2）、 （3）。其中，J0為初始通量，單位m／s；Jt為單位時間t 時的膜通量，單位m／s；m 為膜通量衰減系數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 納濾分離數(shù)據(jù)積累 根據(jù)響應(yīng)面分析原理［10-11］，為保障實驗結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性，每組平行3 次，取平均值，結(jié)果見表2。

表2 試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

3.2 模型擬合 對各因素進行二次多項回歸擬合，得方程為Y=39.44-7.26A-4.77B-19.04C+2.43AB+2.96AC-3.23BC+20.52A2+38.28B2+2.20C2，方差分析見表3。由表可知，各因素影響程度依次為C＞A＞B；P＜0.000 1，表明模型極顯著；多元相關(guān)系數(shù)R2=0.985 7，預(yù)測R2=0.824 8，調(diào)整R2=0.967 3，表明模型擬合度良好。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

3.3 因素分析 圖2 顯示，在固定膜孔徑、乙醇體積分數(shù)時，隨著pH 值逐漸升高，截留率呈先下降后升高的趨勢，并在30%乙醇中最明顯，推測水蘇堿兩性結(jié)構(gòu)中堿性、酸性基團解離狀態(tài)不同，pH 增加時堿性基團陽離子首先過渡至化合物等電點，然后在堿性環(huán)境中羧基解離成陰離子，再結(jié)合納濾分離的電荷效應(yīng)［12］；在固定pH 值、乙醇體積分數(shù)時，截留率隨著孔徑增加而降低，分離規(guī)律符合孔徑篩分規(guī)律；在固定pH 值、膜孔徑時，乙醇體積分數(shù)對截留率的影響呈不同的調(diào)節(jié)規(guī)律，在酸堿極端環(huán)境下，乙醇可增強納濾膜截留效率，但在中性至弱堿條件下，反而會促進成分納濾透過。

表2、圖2 顯示，水蘇堿中的羧基在強堿性條件下以鈉鹽形式存在，與納濾膜電荷排斥效應(yīng)明顯，在475 Da 納濾中的截留率高于80%，乙醇體積分數(shù)從5%升至30%時，截留率由82.32%升至91.48%；在酸性條件下，水蘇堿以鹽酸鹽形式存在，乙醇體積分數(shù)從5%升至30%時，截留率由95.22%升至96.29%，推測堿性條件下該成分可能未完全解離，納濾分離時產(chǎn)生的電荷排斥效應(yīng)弱于酸性條件。

3.4 膜溶脹分析 表4 顯示，隨著乙醇體積分數(shù)增加，衰減系數(shù)絕對值也隨之升高，相較于水溶液環(huán)境，乙醇體積分數(shù)增加至5%時單位時間內(nèi)膜通量衰減明顯，隨著其升高通量衰減加劇，但超過17.5%后衰減系數(shù)相對穩(wěn)定，表明膜溶脹程度已趨于穩(wěn)定［13］。

圖2 各因素響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots for various factors

表4 不同乙醇體積分數(shù)下納濾膜衰減系數(shù)Tab.4 Decay coefficients of nanofiltration membranes under different ethanol concentrations

4 討論

隨著溶液環(huán)境由水逐步向有機相過渡，成分狀態(tài)、膜面分離層物化性質(zhì)、成分的跨膜傳質(zhì)行為均發(fā)生變化，進而引起分離行為變化［14-15］。其中，在酸、堿性條件下乙醇體積分數(shù)增加引起的水蘇堿截留率升高，表現(xiàn)出不同程度“強化” 截留率的行為，而且其升高程度并不完全是由膜面溶脹引起的。同時表2 顯示，在150 Da 納濾膜中，pH 7.0下乙醇體積分數(shù)從5%升高至30%時，截留率由81.87%降低至70.42%，即乙醇體積分數(shù)升高引起膜溶脹加劇，水蘇堿截留率反而下降，與上述結(jié)果相悖，推測兩性生物堿納濾跨膜傳質(zhì)機制可能與成分存在狀態(tài)相關(guān)。

納濾分離的經(jīng)典模型大多基于水溶液環(huán)境建立，其適用性有待于驗證，本實驗中水蘇堿納濾截留行為隨著乙醇體積分數(shù)、pH 值變化的現(xiàn)象僅靠電荷效應(yīng)、位阻效應(yīng)等分離模型無法得到有效解釋。對水蘇堿存在狀態(tài)進行分析，發(fā)現(xiàn)隨著溶液pH 由酸性向堿性環(huán)境的過渡，該成分呈現(xiàn)出酸、堿性基團解離-游離的轉(zhuǎn)換狀態(tài)，當(dāng)兩性基團正負電荷數(shù)值相等時，即為等電點。由此推測，酸、堿性條件下水蘇堿在乙醇中的解離基團隨著溶劑體積分數(shù)升高，其溶解度逐步降低，而游離態(tài)基團溶解度變化隨之相反，從而表現(xiàn)出類表面活性劑性質(zhì)，并通過分子間締合團聚的形式在溶液中存在，故在納濾過濾時“強化” 截留率是由膜面溶脹和分子團聚綜合引起的。另外，在水蘇堿等電點附近呈電中性狀態(tài)，由于乙醇可降低分子間表面能，促進多分子團聚態(tài)狀態(tài)向低分子團聚態(tài)或單分子態(tài)轉(zhuǎn)移，而且此時單分子、低分子團聚態(tài)水蘇堿比例高于水溶液環(huán)境，故此時“削弱” 截留率的行為可能是由存在狀態(tài)結(jié)構(gòu)大小、膜面溶脹引起的。

對水蘇堿跨膜傳質(zhì)過程進行分析，推測在含有乙醇的水溶液環(huán)境中，等電點時水蘇堿可能更容易接近膜分離層而通過納濾膜，同時因分子間作用力差異，乙醇與復(fù)合聚酰胺材質(zhì)作用力大于水分子，推測納濾膜表面乙醇體積分數(shù)可能稍高于溶液內(nèi)部。因此，解離態(tài)水蘇堿因溶解度與乙醇體積分數(shù)呈反比，并在膜面電荷排斥的協(xié)同作用下難以進入膜分離層，從而呈現(xiàn)出高截留率現(xiàn)象。

有機溶劑的合理回收和循環(huán)利用有助于中藥制藥企業(yè)實現(xiàn)節(jié)能減排，但分離機制有待于進一步完善。本實驗對兩性化合物水蘇堿在乙醇中的納濾分離行為進行分析，今后將結(jié)合分離規(guī)律建立納濾傳質(zhì)模型，從而為提升化學(xué)成分在有機溶液環(huán)境中的適用性、研制耐有機溶劑納濾膜提供技術(shù)支撐。