米蘭，蔣玉梅，李霽昕，趙毓璇，布鑫榮，畢陽，韓舜愈

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅蘭州 730070；3甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)為胡頹子科酸刺屬的灌木或小喬木，別名黑刺、酸刺[1].為藥食同源性植物[2].含有豐富的黃酮、多酚、維生素、礦物質(zhì)[3]及其他活性成分[4]，具有非常高的營養(yǎng)價值及抗氧化性.但由于沙棘果中糖含量較低，一般無法發(fā)酵到國標(biāo)所要求的果酒酒精度為8%以上的界限標(biāo)準(zhǔn)，同時沙棘中的有機酸含量過高也會影響酵母的正常生長代謝.因此在沙棘原漿中添加一定比例的釀酒葡萄汁，可以很好地補充發(fā)酵過程中由于糖量不足所造成的酒精度不高的缺陷，同時也可以適當(dāng)稀釋沙棘原漿中的有機酸含量，并且做出的復(fù)配酒與普通‘赤霞珠’葡萄酒相比多酚和有機酸等物質(zhì)的含量均有升高[5-6]，同時又增加了‘赤霞珠’葡萄酒特有的香氣顏色與高單寧的特點[9]，增加了產(chǎn)品的營養(yǎng)價值和附加經(jīng)濟價值.因此沙棘葡萄酒可以有效彌補兩種物質(zhì)各自的缺點，同時可以優(yōu)點互補，在釀出具有豐富層次，飽滿口感的復(fù)合酒的基礎(chǔ)上，增加黃酮，維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的含量.

現(xiàn)今國內(nèi)外對沙棘的應(yīng)用主要集中在對其營養(yǎng)成分、生態(tài)價值、藥用價值等領(lǐng)域[10]，而利用沙棘釀酒的研究多為通過單因素試驗優(yōu)化釀造工藝或后期調(diào)配酒的生產(chǎn).如郭成宇等[11]以沙棘汁為原料，通過正交試驗確定了干紅沙棘果酒發(fā)酵的最佳工藝條件；田夢媛等[12]研究了果膠酶對沙棘葡萄酒的最佳酶解工藝條件；劉巖松等[13]分別用發(fā)酵法和浸泡法生產(chǎn)沙棘原酒，并以此為原料進行勾調(diào)酒的研發(fā)；牛廣財?shù)萚14]對沙棘酒的主發(fā)酵條件進行了優(yōu)化.在混合發(fā)酵方面，趙志永等[15]以沙棘和‘霞多麗’葡萄為原料發(fā)酵出沙棘葡萄酒并對其營養(yǎng)成分進行了檢測；劉瑩等[16]研究了沙棘汁與‘巨峰’葡萄混合釀制沙棘葡萄酒的最佳工藝條件.目前國外對沙棘的研究較多.但也僅局限于營養(yǎng)成分[17]，生態(tài)種植[18]及抗氧化能力[19]等方面.綜上所述，國內(nèi)外現(xiàn)有研究僅在正交試驗的層面對沙棘與釀酒葡萄復(fù)配酒的釀造工藝進行了簡單優(yōu)化，并沒有對其成分，特別是對沙棘原料中的特征性成分例如黃酮、總酸高的特點對釀造后的復(fù)合酒產(chǎn)生的影響進行研究.

本試驗將沙棘汁與‘赤霞珠’葡萄汁混合進行發(fā)酵，一方面能明顯改善沙棘酒單一的風(fēng)味，中和其尖酸的口感；另一方面可使發(fā)酵而成的葡萄酒具有更高的VC和黃酮含量[20]，增加保健性[21].本試驗研究了沙棘原漿與葡萄汁配比、酵母添加量、發(fā)酵天數(shù)與發(fā)酵溫度4個因素對最終產(chǎn)品酒精度和黃酮含量的影響.在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗進一步優(yōu)化發(fā)酵條件，旨在保證產(chǎn)品具有較高酒精度的前提條件下最大限度的增加黃酮含量.與市售葡萄酒成分對比，沙棘葡萄酒具有更豐富的營養(yǎng)物質(zhì)與風(fēng)味物質(zhì).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘原漿由甘肅高原圣果華池沙棘開發(fā)有限公司提供，可溶性固形物為12.4 Brix；‘赤霞珠’葡萄由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄園提供；市售100%‘赤霞珠’葡萄酒.

CPJ214電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；DK-8D電熱恒溫三孔水槽，上海森信試驗儀器有限公司；DNP-9082BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限司；沸點測定儀，上海光譜儀器有限公司；TD-45數(shù)字折射儀，上海精密儀器儀表有限公司；新銳T6紫外可見分光光度計，湖南湘儀離心機儀器有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 酒精度的測定 參見代秀芝[22]的方法，使用沸點測定儀測定.轉(zhuǎn)動表盤，將表盤的“0”酒度刻度線與水沸點對齊，酒沸點所對應(yīng)的外圈酒度值即為該葡萄酒的酒精含量.

1.2.2 黃酮的測定 參見鐘方麗等[23]的方法.稱量13.2 mg蘆丁，用60%乙醇定容到25 mL容量瓶作為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液.使用紫外可見分光光度計，以蘆丁含量的濃度作為橫坐標(biāo)，一定濃度下所對應(yīng)的吸光度作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算黃酮含量.

式中，A：吸光度；M：摩爾質(zhì)量(g/mol).

1.2.3 多酚含量的測定 參見李浡等[24]的方法，使用酶提取法分別測定沙棘葡萄酒和‘赤霞珠’葡萄酒中的多酚含量.

1.2.4 總酸含量的測定 參見賈柳軍等[25]的方法，用近紅外光譜分析技術(shù)對沙棘葡萄酒和‘赤霞珠’葡萄酒發(fā)酵液中的總酸含量進行測定.

1.2.5 還原糖的測定 參見劉燁等[26]的方法，用直接滴定法測定沙棘葡萄酒和‘赤霞珠’葡萄酒中的還原糖含量.

1.2.6 VC含量的測定 參見梁飛燕[27]的方法，采用2,6-二氯靛酚法測定沙棘葡萄酒和‘赤霞珠’葡萄酒中VC的含量.

1.2.7 單因素試驗設(shè)計

1.2.7.1 沙棘汁與葡萄汁配比對酒精和黃酮含量的影響 參照劉瑩等[16]的方法，在發(fā)酵天數(shù)、酵母添加量、發(fā)酵溫度分別為11 d、0.3 g/L、25 ℃的條件下固定不變，設(shè)置沙棘汁與葡萄汁的配比分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5進行發(fā)酵，以成品酒精度與黃酮含量為指標(biāo)，進行單因素試驗，每個試驗重復(fù)3次.

1.2.7.2 酵母添加量對酒精和黃酮含量的影響 在發(fā)酵天數(shù)、發(fā)酵溫度、沙棘汁與葡萄汁的配比分別為11 d、25 ℃、2∶8的條件下固定不變，設(shè)置酵母添加量分為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L進行發(fā)酵，以成品酒精度與黃酮含量為指標(biāo)，進行單因素試驗，每個試驗重復(fù)3次.

1.2.7.3 發(fā)酵溫度對酒精和黃酮含量的影響 在發(fā)酵天數(shù)、沙棘汁與葡萄汁的配比、酵母添加量分別為11 d、2∶8、0.3 g/L的條件下固定不變，設(shè)置發(fā)酵溫度分別為21、23、25、27、29 ℃進行發(fā)酵，以成品酒精度與黃酮含量為指標(biāo)，進行單因素試驗，每個試驗重復(fù)3次.

1.2.7.4 發(fā)酵天數(shù)對酒精和黃酮含量的影響 在沙棘汁與葡萄汁的配比、酵母添加量、發(fā)酵溫度分別為2∶8、0.3 g/L、25 ℃的條件下固定不變，設(shè)置發(fā)酵天數(shù)分別為7、9、11、13、15 d進行發(fā)酵，以成品酒精度與黃酮含量為指標(biāo)，進行單因素試驗，每個試驗重復(fù)3次.

1.2.8 響應(yīng)面試驗設(shè)計 使用Design Expert 8.0軟件，通過單因素試驗確定響應(yīng)面優(yōu)化法試驗的各因素水平.

表1 響應(yīng)面分析因素及水平編碼表

1.2.9 驗證試驗 為確保響應(yīng)面優(yōu)化條件的準(zhǔn)確度，采用優(yōu)化條件展開3次驗證試驗，按以下公式將試驗得出的沙棘葡萄酒發(fā)酵后的酒精度和黃酮含量與理論值進行對比并計算相應(yīng)誤差.

1.2.10 沙棘葡萄酒與市售‘赤霞珠’葡萄酒的品質(zhì)檢測

1.2.10.1 理化指標(biāo)檢測方法 測定沙棘葡萄酒中的多酚、總酸、還原糖和VC含量，并與市售‘赤霞珠’單品種釀制的紅葡萄酒中相應(yīng)成分進行對比.

1.2.10.2 感官鑒定 組成10人品鑒小組，對沙棘葡萄酒與市售單品種‘赤霞珠’紅葡萄酒的感官品質(zhì)按照表2進行打分，評分結(jié)果利用Excel制作雷達圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

沙棘葡萄酒的酒精度隨著原料中沙棘汁所占比例的增加而逐漸降低(圖1)，是因為隨著原料中沙棘汁比例逐漸增加，原料中的總糖含量相應(yīng)減少.酒精度由最初的9.5%下降到8.4%，降幅為11%.而黃酮含量隨著原料中沙棘汁所占比例的增加而增加，由最初的18.65 mg/L，增加到最大值21.85 mg/L，增幅為1.2倍，是由于沙棘果中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，隨著沙棘汁所占比例的增加，黃酮類物質(zhì)的含量逐漸增加.

表2 葡萄酒評分細(xì)則表及感官要求(中國葡萄酒國家標(biāo)準(zhǔn))

圖1 配比對酒精度與黃酮含量的影響Figure 1 The influence of proportion of alcohol and ftavonoids content

圖2 酵母添加量對酒精度與黃酮含量的影響Figure 2 The influence of yeast addition of alcohol and ftavonoids content

其他條件不變的情況下，沙棘葡萄酒中的酒精度和黃酮含量隨著酵母添加量的增加有所提高但增幅不明顯(圖2).主要是因為產(chǎn)品中最終的酒精度是由原料中的總糖量決定的，酵母添加量只會影響酒精發(fā)酵的快慢，對酒精度的大小沒有實質(zhì)性的影響；而原料中的黃酮含量在確定了沙棘汁與葡萄汁的配比后也基本確定.發(fā)酵的過程中由于微生物的代謝會消耗一些黃酮類物質(zhì)，但消耗量并不大[24].

其他條件不變，隨著溫度的升高，酒精度持續(xù)增加(圖3)，由8.35%增加到9.515%，是由于隨著溫度的升高，酵母活性增強，轉(zhuǎn)化糖的能力增強，當(dāng)溫度為29 ℃時，酒精度含量最高，達到了9.515%，增幅達到1.1倍.黃酮含量變化不明顯，在25 ℃之后有所降低，是因為黃酮屬于酚類物質(zhì)，在25 ℃時提取最佳，后隨溫度的上升會對其化學(xué)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，不易被提取出來，故隨著溫度的升高黃酮提取量稍有下降.在25 ℃時黃酮被最大的提取出來，達到21.09 mg/L，增幅為1倍.

圖3 溫度對酒精度與黃酮含量的影響Figure 3 The influence of temperature of alcohol and ftavonoids content

在其他條件不變的前提下，酒精度在第9天達到峰值(圖4)，為9.93%，證明在發(fā)酵第9天時釀酒酵母對原料中的糖的轉(zhuǎn)化量達到最大值，第9天之后沙棘葡萄酒的酒精含量基本保持不變，說明發(fā)酵體系中的糖基本已全部轉(zhuǎn)化為酒精.而隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，復(fù)配酒中的黃酮含量逐漸增加，這是因為隨著發(fā)酵時間延長，黃酮類物質(zhì)的析出率在發(fā)酵過程中逐漸被提取出來，但由于主要的黃酮類物質(zhì)含在果肉果皮中，故增幅并不明顯.

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken的要求，展開了17組試驗，響應(yīng)面分析見表3.

2.2.1 酒精度回歸方程的建立及顯著性檢測 試驗數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計分析回歸處理后得到酒精度與4個變量的回歸方程：

Y1=9.25-0.59X1+0.22X2-0.061X3-0.075X1X2-0.050X1X3+0.000X2X3-2.30X12-1.11X22-0.53X32

對該方程進行方差分析，結(jié)果見表4.

圖4 發(fā)酵天數(shù)對酒精度與黃酮含量的影響Figure 4 The influence of fermentation days of alcohol and ftavonoids content

表3 試驗設(shè)計與結(jié)果

表4 酒精度方差分析結(jié)果

***：差異極顯著(P<0.001)；**：差異高度顯著(P<0.01)；*：差異顯著(P<0.05).

***：Very significant difference；**：Hightly significant difference；*：Significant difference.

由表4顯著性分析可知，溫度B及B2的P值均小于0.001，表明差異及顯著，A、C及C2的P值均小于0.01，表明差異高度顯著， AB、BC及B2的P值均小于0.05，表明差異顯著.

由圖5的響應(yīng)面圖可以看出，發(fā)酵天數(shù)與溫度對酒精度影響顯著.酒精度的最大值為9.38%.

圖5 發(fā)酵天數(shù)與溫度兩因素交互作用對酒精度的影響Figure 5 Effects of interavtion between fermenting days and temperature on alcohol accuracy

2.2.2 黃酮含量回歸方程的建立及顯著性檢測 試驗數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計分析回歸處理后得到黃酮含量與4個變量的回歸方程：

Y2=20.98-0.57X1+0.23X2+0.074X3+0.050X1X2-0.12X1X3+0.23X2X3-2.05X12-1.05X22-0.61X32

對該方程進行方差分析，結(jié)果見表5.

表5 黃酮含量方差分析結(jié)果

***：差異極顯著(P<0.001)；**：差異高度顯著(P<0.01)；*：差異顯著(P<0.05).

***：Very significant difference：**：Hightly significant difference；*：Significant difference.

由表5顯著性分析可知，配比A、B、A2及B2的P值小于0.001，表明差異極顯著， AB、BC、C2的P值均小于0.01，故差異高度顯著，發(fā)酵天數(shù)C的P值小于0.05，表明差異顯著.

由圖6的響應(yīng)面圖可以看出，發(fā)酵天數(shù)與配比對黃酮含量有顯著的影響，黃酮含量達到最大值22.47 mg/L.

2.2.3 驗證試驗 響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳工藝條件為：配比為2.18∶7.82，溫度為25.63 ℃，發(fā)酵天數(shù)為11.06 d.為確保響應(yīng)面優(yōu)化條件的準(zhǔn)確度采用優(yōu)化條件展開了3次驗證試驗，為了方便實際操作，將配比取為2∶8，溫度取為26℃，發(fā)酵天數(shù)取為11 d.試驗得出發(fā)酵過程中酒精的平均度數(shù)為9.38%，相對誤差4.2%，黃酮的平均含量為22.47 mg/L，相對誤差為2.1%，因此響應(yīng)面的設(shè)計所得的優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可解決實際問題.

圖6 沙棘汁和葡萄汁配比和發(fā)酵天數(shù)兩因素交互作用對黃酮含量的影響Figure 6 Effects of the interation between sebuckthorn juice and grape juice and fermentation days on the content of ftavonoids

2.3 沙棘葡萄酒與‘赤霞珠’葡萄酒的理化指標(biāo)對比

由上圖可以看出，沙棘葡萄酒的每一項理化指標(biāo)均高于‘赤霞珠’葡萄酒，其中，以多酚和總酸含量升高的較為明顯，具有更好的營養(yǎng)價值.

表6 理化指標(biāo)對比

2.4 感官分析結(jié)果

經(jīng)評分小組根據(jù)感官評價表對酒樣的感官進行評價打分后得知，沙棘葡萄酒的色澤和澄清度并沒有‘赤霞珠’葡萄酒好，但香氣和滋味有一定的優(yōu)勢.這是因為沙棘果汁本身固形物含量較高，是一種漿狀液體，很難澄清.由于沙棘原漿呈黃色，與葡萄汁混合發(fā)酵后制作出的沙棘葡萄酒呈現(xiàn)出磚紅色，與赤霞珠葡萄酒的寶石紅色相比，稍顯遜色.在后續(xù)研究中對沙棘葡萄酒的色澤改良與澄清問題需進一步研究.

圖7 感官評價Figure 7 Sensory evaluation

3 討論

本試驗利用單因素和響應(yīng)面試驗對沙棘葡萄混釀酒的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化.沙棘原漿由于具有酸度高，黃酮含量高但糖度低的特點如不經(jīng)過調(diào)配很難在短時間內(nèi)發(fā)酵成酒精度符合標(biāo)準(zhǔn)并且口感適宜的果酒，現(xiàn)今大量的文獻中對沙棘酒的制作大多集中在原料前期稀釋加糖的方法.本試驗利用釀酒葡萄‘赤霞珠’原汁與沙棘原漿復(fù)配作為原料進行發(fā)酵制備新型的復(fù)合果酒，對最終產(chǎn)品的主要代表性營養(yǎng)成分進行檢測并與市售‘赤霞珠’葡萄酒進行對比后證明，沙棘葡萄酒中的多酚、總酸和VC的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通‘赤霞珠’葡萄酒，這是沙棘的產(chǎn)品特性決定的.同時，‘赤霞珠’為沙棘葡萄酒提供了可發(fā)酵至適宜酒精度的糖，極大豐富了產(chǎn)品的香氣和口感.但是由于沙棘原漿的固形物含量偏高，并且類胡蘿卜素的含量非常高，整體呈現(xiàn)橙黃色，造成發(fā)酵后沙棘葡萄酒的澄清工藝比普通葡萄酒的復(fù)雜，且產(chǎn)品最終呈現(xiàn)出磚紅色的特點.這需要后續(xù)對發(fā)酵條件影響產(chǎn)品色調(diào)的規(guī)律進行進一步的研究.利用響應(yīng)面優(yōu)化可以比單一的單因素試驗更精確地反映出沙棘葡萄復(fù)配酒的最佳釀造工藝，本試驗選擇產(chǎn)品酒精度與黃酮含量作為沙棘葡萄酒的品質(zhì)判斷指標(biāo)，結(jié)合感官鑒定最終優(yōu)化了沙棘葡萄酒的發(fā)酵工藝.同時也明確了各發(fā)酵條件對產(chǎn)品品質(zhì)變化影響的相關(guān)性，為后續(xù)的試驗提供了一定的參考價值.

4 結(jié)論

本試驗利用單因素試驗對沙棘葡萄混釀酒的沙棘汁與葡萄汁原料配比、發(fā)酵天數(shù)，酵母加入量，發(fā)酵溫度4個指標(biāo)進行了優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面試驗研究了發(fā)酵溫度、發(fā)酵天數(shù)和沙棘汁與葡萄汁配比3個參數(shù)對復(fù)合酒的酒精度和最終產(chǎn)品黃酮含量的互作規(guī)律.結(jié)果表明酵母添加量與發(fā)酵溫度對整體發(fā)酵過程的持續(xù)時間有著顯著的影響，而發(fā)酵天數(shù)與溫度對酒精度影響顯著.結(jié)合感官鑒定當(dāng)產(chǎn)品中酒精度為9.38%時達到感官品質(zhì)最優(yōu)值.發(fā)酵天數(shù)與原料中葡萄汁與沙棘汁配比對最終產(chǎn)品黃酮含量有顯著的影響，感官達到最優(yōu)時產(chǎn)品黃酮含量達到最大值為22.47 mg/L.經(jīng)過驗證試驗表明由響應(yīng)面得到的最佳沙棘葡萄酒的發(fā)酵工藝條件為：沙棘汁與葡萄汁配比為2∶8，溫度為26 ℃，發(fā)酵天數(shù)為11 d.在此條件下沙棘葡萄酒酒精度數(shù)為9.38%，黃酮的平均含量為22.47 mg/L.與理論相對誤差分別是4.2%和2.1%，因此響應(yīng)面的設(shè)計所得的優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可解決實際問題.將沙棘葡萄酒與市售‘赤霞珠’葡萄酒進行營養(yǎng)成分對比可知，沙棘葡萄酒中的多酚、總酸、還原糖和VC的含量均高于普通‘赤霞珠’葡萄酒，特別是多酚與總酸，分別高出14.06%和4.49%.利用沙棘汁與葡萄汁原料復(fù)配發(fā)酵生產(chǎn)的沙棘葡萄酒不僅能夠得到優(yōu)良的口感，還彌補了由沙棘單品種原料發(fā)酵酒時經(jīng)常因糖度不足酸度過高，最終造成發(fā)酵時間延長、酒精度過低與酵母生長受抑制的缺陷；同時也比普通葡萄酒含有更多的黃酮、多酚和有機酸，營養(yǎng)價值得以提高.因此，沙棘葡萄酒的開發(fā)不僅豐富了果酒品種，更是充分了利用了西北特色原料沙棘，對其產(chǎn)品的深加工與地方產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟的拉動具有實際意義.