白海紅，王興河，車津晶

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥物Ⅰ期臨床試驗研究室，北京100038；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京100850）

血液是臨床檢驗中最常用的體液樣本。血液中包含了許多從組織脫離或由細胞分泌的重要物質(zhì)，對于疾病的早期診斷、藥物療效評價及預(yù)后評估具有極為重要的臨床意義［1-2］。其中，外泌體是一類由細胞分泌并釋放入血液、尿液及唾液等體液的納米級多囊泡體（30～100 nm），其內(nèi)部包裹了大量的蛋白質(zhì)、DNA 和微?。╩icroRNA，miRNA）等活性成分［3-4］。外泌體在發(fā)現(xiàn)之初只被認(rèn)為是細胞的“垃圾袋”，所以才被排出。但近年來的研究表明，外泌體具有重要的生物學(xué)意義，尤其外泌體攜帶的許多蛋白質(zhì)已被證實參與到細胞通訊、神經(jīng)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及腫瘤等重要疾病的發(fā)生發(fā)展過程中。同時，外泌體蛋白質(zhì)的翻譯后修飾也與腫瘤等細胞的發(fā)生、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［5］。

N-糖基化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型。真核生物約＞50%的蛋白質(zhì)都發(fā)生了N-糖基化修飾。N-糖基化修飾幾乎參與了所有重要的生命進程，如蛋白折疊、免疫應(yīng)答、細胞識別及相互作用等［6-7］。同時，有研究表明，多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中均伴隨著蛋白質(zhì)N-糖基化修飾組成與結(jié)構(gòu)的改變，如代謝性疾病、心力衰竭及惡性腫瘤等。美國食品與藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)的腫瘤標(biāo)志物中有約30%為N-糖基化蛋白質(zhì)。如用于卵巢癌診斷的人癌抗原125（cancer antigen 125，CA125），用于前列腺癌篩查的前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）及用于肝癌診斷的α-甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）等［8-10］。鑒于此，規(guī)?；ㄐ苑治鋈搜獫{外泌體中N-糖基化蛋白質(zhì)的表達變化不僅有利于對其結(jié)構(gòu)和功能進行認(rèn)知，同時也對疾病診斷、治療及治療靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)有重要的指導(dǎo)價值。

目前，對外泌體N-糖基化蛋白質(zhì)的研究并不多見。首要的原因是蛋白質(zhì)N-糖基化修飾無模板，具有微不均一性（microheterogenicity）；其次，N-糖基化蛋白質(zhì)基本都是低豐度表達蛋白質(zhì)，外泌體中包含的大量高豐度蛋白質(zhì)及肽段對其直接檢測構(gòu)成干擾［11-12］。基于以上原因，對人血漿外泌體中的N-糖基化蛋白質(zhì)進行高效特異的分離富集是實現(xiàn)其通量（throughput）化檢測并進一步對其結(jié)構(gòu)和功能全面而整體認(rèn)知的重要前提。現(xiàn)有的針對N-糖基化蛋白質(zhì)的分離富集方法主要有凝集素親和富集法、親水相互作用色譜法、硼酸富集法及肼化學(xué)法等［13-16］。Sok等［17］采用超濾法提取血漿中的外泌體并對其進行親水富集，在5 mL 人血漿中共鑒定到127 個N-糖基化蛋白質(zhì)。而與親水相互作用色譜法相比，肼化學(xué)法是通過酰肼官能團和氧化糖鏈的特異性反應(yīng)實現(xiàn)N-糖基化蛋白質(zhì)的高效富集，因此具有更高的特異性。但基于肼化學(xué)法的人血漿外泌體N-糖基化蛋白質(zhì)鑒定研究尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

甲酸（FA）、1，4-二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、尿素和商品化酰肼樹脂（美國Sigma 公司）；p H 7.4 PBS 緩沖液（美國Life Technologies公司）；測序級胰蛋白酶（美國Promega 公司）；PNGase F糖苷酶（美國NEB公司）；乙腈（ACN）和碳酸氫銨（NH4HCO3）（北京化學(xué)試劑公司）；H218O（上海生工生物工程股份有限公司）；所有實驗用水由Milli-Q純水系統(tǒng)制備（美國Millipore 公司）；健康人血漿樣品為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥物Ⅰ期臨床試驗研究室的工作人員捐獻。

真空冰凍干燥機SC100A Speedvac Plus（美國Thermo Savant 公司）；Sartorius BP211d 分析天平（德國Sartorius公司）；Optima?XPN超速離心機（德國Beckman公司）；3K30型高速離心機（美國Sigma 公司）；NanoDrop 2000c超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Thermo Orion Model 818 型p H 計（美國Thermo 公司）；日立H-7650 投射電子顯微鏡（日本日立公司）；Q-Exactive 質(zhì)譜儀和Easy-nano LC 1000 液相色譜系統(tǒng)（美國Thermo Fisher公司）。

1.2 超速離心法提取人血漿外泌體及血漿外泌體蛋白的酶解

取1 mL 健康人血漿，加等體積PBS（p H=7.4），于4oC離心2次（分別為2000×g，30 min，12 000×g 45 min），去除沉淀。將上清轉(zhuǎn)移到超速離心管中，于4℃110 000×g 離心60 min。小心去除上清液，用10 mL PBS 稀釋沉淀。再將所得溶液于4℃110 000×g 離心70 min，小心去除上清液。最后所得即血漿外泌體，用0.1 mL NH4HCO30.05 mol·L-1溶液（含尿素8 mol·L-1）溶解沉淀，400 W超聲90 s釋放外泌體中蛋白質(zhì)。BCA法對蛋白進行定量。

在上述提取的血漿外泌體蛋白溶液中加入終濃度為0.01 mol·L-1DTT后，于37℃水浴還原變性4 h，冷卻后，加終濃度為0.05 mol·L-1IAA，避光放置1 h，0.7 NH4HCO30.05 mol·L-1溶液8 倍稀釋，按每0.1 mg 蛋白質(zhì)加1 μg 胰蛋白酶，于37℃水浴進行酶解。

1.3 血漿外泌體N-糖基化蛋白質(zhì)的富集和LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定

采用張慧等［18-19］報道的肼化學(xué)法進行血漿外泌體N-糖基化蛋白質(zhì)的富集。將酶解后的血漿外泌

體蛋白質(zhì)肽段進行C18脫鹽處理，加入終濃度為10 mmol·L-1高碘酸鈉溶液，于4℃避光氧化30 min；隨后，將氧化后的肽段第二次C18脫鹽處理，加0.2 mL 商品化酰肼樹脂，室溫孵育過夜。次日將上述體系10 000×g 離心10 min，棄上清。用洗滌溶液（含二甲基甲酰胺1 mL、尿素8 mol·L-1、氯化鈉1.5 mol·L-1和NH4HCO30.05 mol·L-1）洗滌2 次去除非糖肽［19］。最后，將富集有N-糖基化蛋白質(zhì)的酰肼樹脂混懸于0.1 mL NH4HCO30.05 mol·L-1溶液（H218O）中，按酶和蛋白質(zhì)量比1 U∶10 μg 加PNGase F 酶，于37℃孵育過夜，將釋放的N-糖肽脫鹽，取2 μg進行質(zhì)譜鑒定。

高效液相色譜儀型號為Easy-nLC 1000，配自動進樣器，上樣體積為20 μL。液相色譜條件：流動相由A：0.1% FA 水溶液和B：0.1% FA-100%ACN 溶液組成。洗脫條件：0～16 min，6% B-10%B；16～51 min，10% B-22% B；51～71 min，22% B-30%B；71～72 min，30%B-95%B。流動相的流速為600 nL·min-1。質(zhì)譜采集條件：源溫為320℃；噴霧電壓為2.0 kV；一級質(zhì)譜的分辨率為70 000 且AGC為3e6，最大注入時間為20 ms；二級質(zhì)譜分辨率為17 500 且AGC 為1e6，最大注入時間為60 ms；質(zhì)譜掃描范圍設(shè)置為m/z 300.0～1400.0；肽段碎裂方式為高能誘導(dǎo)裂解（higher energy collision induced dissociation，HCD）且氮氣為裂解氣；平均碎裂能量為27%；MS/MS 譜圖數(shù)據(jù)檢索用Maxquant 1.5.2.8 軟件（美國Thermo 公司）進行分析。搜庫條件如下：胰蛋白酶酶解；允許有2個漏切位點；一級質(zhì)譜的誤差為20 ppm；脲甲基化修飾為固定化修飾；氧化、脫氨基和乙?；癁榭勺冃揎棧浑亩渭訇栃月试O(shè)置為1%；N-糖肽是通過N-X-S/T（X是除脯氨酸外的任意氨基酸）2.988 u質(zhì)量遷移鑒定的。

1.4 基因本體（gene ontology，GO）分析

在線https：//david.ncifcrf.gov/完成上述鑒定的人血漿外泌體N-糖基化蛋白的分子功能、生物學(xué)過程及細胞組成等。

2 結(jié)果

2.1 人血漿外泌體的提取及蛋白酶解

外泌體外觀形態(tài)透射電鏡觀察結(jié)果（圖1）顯示，獲得的外泌體具有外泌體典型的茶托樣雙層膜結(jié)構(gòu)，且形態(tài)完整，大小均勻，直徑約100 nm。蛋白定量結(jié)果表明，1 mL 人血漿含外泌體蛋白約0.228 mg。

Fig.1 Morphology of human plasma exosomes by transmission electron microscope. The arrow indicated human plasma exosome.

2.2 人血漿外泌體N-糖基化蛋白質(zhì)的富集及質(zhì)譜鑒定

高通量質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，1 mL人血漿樣品中共鑒定到252個N-糖基化修飾位點，鑒定到155個蛋白質(zhì)，其中131 個為N-糖基化蛋白質(zhì)，對N-糖基化蛋白質(zhì)的富集特異性為84.5%。對131 個N-糖基化蛋白質(zhì)在Nextprot 數(shù)據(jù)庫中進行分析，發(fā)現(xiàn)67 個N-糖基化蛋白質(zhì)（128 個N-糖基化修飾位點）與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)（表1）。

2.3 人血漿外泌體N-糖基化蛋白質(zhì)的GO分析

N-糖基化蛋白質(zhì)的GO 分析結(jié)果（圖2）顯示，本研究鑒定的N-糖基化蛋白質(zhì)79.4%位于外泌體，提示獲得的外泌體純度較好（圖2A）；分子功能分析結(jié)果（圖2B）顯示，這些蛋白質(zhì)主要與血小板顆粒釋放、蛋白質(zhì)酶解及內(nèi)肽酶活性負(fù)調(diào)節(jié)等生物功能相關(guān)；生物學(xué)過程分析結(jié)果（圖2C）顯示，這些蛋白質(zhì)主要與絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性抑制及鈣離子結(jié)合等生物學(xué)過程相關(guān)。

Tab.1 N-Glycoproteins and N-glycosylation sites of human plasma exosome enriched by hydrazide chemistry based method identified by mass spectrometry and their relations probability with diseases

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

Fig.2 GO analysis of N-glycoproteins from human plasma exosomes. Top 10 significantly enriched GO categories were indicated. A：cellular component；B：molecular function；C：biological process.

3 討論

人血漿外泌體中包含了大量從組織脫離或由細胞分泌的N-糖基化蛋白質(zhì)。系統(tǒng)分析人血漿外泌體中N-糖基化蛋白質(zhì)的組成和功能對疾病診斷、治療及治療靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)都具有重要意義。

高純度外泌體的獲得對后續(xù)研究工作至關(guān)重要。本研究采用低溫條件下對樣品進行反復(fù)的低速及高速離心，分離得到囊泡沉淀。該沉淀具有外泌體典型的茶托樣雙層膜結(jié)構(gòu)且顆粒直徑分布約在100 nm。

本研究在1 mL人血漿樣品中共鑒定到252個N-糖基化修飾位點，歸屬于131 個N-糖基化蛋白質(zhì)。高于文獻報道的采用5 mL人血漿進行親水富集的N-糖基化蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量（127個N-糖基化蛋白質(zhì)［17］。由于人血漿外泌體中N-糖基化蛋白質(zhì)基本是低豐度表達蛋白，大量高峰度表達蛋白及肽段對其檢測造成干擾。N-糖基化蛋白質(zhì)高效、特異的分離和富集是實現(xiàn)對其高通量檢測的重要前提，也是進一步對其進行結(jié)構(gòu)和功能全面認(rèn)知的重要前提。肼化學(xué)法是基于糖基化蛋白N-糖鏈中的順式鄰二羥基可被高碘酸或高碘酸鈉等強氧化劑氧化為醛基并進一步通過酰肼和醛基共價連接形成腙的反應(yīng)特異性地將N-糖基化蛋白/糖肽從復(fù)雜的生物體系中分離出來。與其他幾種基于物理吸附的富集方法相比，選擇性較強。該方法由Zhang等［18-19］開發(fā)，利用酰肼官能團和氧化糖鏈的特異性反應(yīng)實現(xiàn)N-糖基化蛋白質(zhì)的高效富集。將肼化學(xué)法、同位素標(biāo)記技術(shù)與質(zhì)譜檢測技術(shù)相結(jié)合，該研究小組在人血清中共富集鑒定得到145條N-糖肽，歸屬于57 個N-糖基化蛋白質(zhì)；而在前列腺癌上皮細胞系的膜蛋白中鑒定得到104條N-糖肽，歸屬于64 個N-糖基化蛋白質(zhì)［18］。Zhu 等［20］利用肼化學(xué)法富集人肝組織中N-糖基化蛋白質(zhì)，富集效率高達90%，將其和親水富集法相結(jié)合共鑒定到2210 個N-糖基化蛋白質(zhì)和4783 個N-糖基化位點。因此，選擇肼化學(xué)法富集可增大人血漿外泌體蛋白中的N-糖基化蛋白質(zhì)的鑒定規(guī)模。

在本研究中，通過對鑒定的131 個N-糖基化蛋白質(zhì)在Nextprot 數(shù)據(jù)庫中進行分析，發(fā)現(xiàn)67 個N-糖基化蛋白質(zhì)與疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。其中41 個與心血管疾病相關(guān)，如動脈粥樣硬化等；39個與腫瘤相關(guān)，例如乳腺癌等；38個與代謝性疾病相關(guān)，如糖尿病等。通過功能分析，發(fā)現(xiàn)鑒定的N-糖基化蛋白質(zhì)主要參與酶活性調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)及免疫反應(yīng)等重要的生物過程。在人血漿外泌體高通量鑒定的基礎(chǔ)上，了解其在細胞成分、分子功能及分子過程等中的重要作用對疾病早期診斷、疾病監(jiān)測及新藥靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)等具有重要的指導(dǎo)意義。