田自有，陳賽貞，周金明，梁 斌

（1.浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，浙江臺(tái)州318000；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京100050）

肉毒神經(jīng)毒素（botulinum neurotoxins，BoNT）于1987 年首次被發(fā)現(xiàn)，是由一種廣泛分布于自然界的革蘭陽(yáng)性厭氧芽孢菌：肉毒梭狀芽孢桿菌（肉毒梭菌，Clostridium botulinum）在厭氧環(huán)境中分泌得到的，是真空包裝食品引起的食物中毒的主要原因之一。迄今共發(fā)現(xiàn)7 種結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的BoNT，分別被稱(chēng)為血清型A～G（BoNT/A～G）。其中A 型（BoNT/A），B 型（BoNT/B），E 型（BoNT/E）和F 型（BoNT/F）BoNT 可引起人類(lèi)中毒，BoNT/A最為常見(jiàn)，它是世界上已知的最致命的毒素之一，其對(duì)人的LD50約為1 ng·kg-1，被美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心（United States Centers For Disease Control and Prevention，USCDC）列為A 類(lèi)生物威脅試劑。而B(niǎo)oNT/F 引起的人類(lèi)中毒非常少見(jiàn)。BoNT/A 和BoNT/B在神經(jīng)元胞質(zhì)中活性保持最久（根據(jù)使用的劑量和部位，可處于活性狀態(tài)幾周或數(shù)月）。目前，BoNT/A（Botox 和Dysport）和BoNT/B（Myobloc）是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的可商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的藥物，臨床上被廣泛用于治療神經(jīng)類(lèi)疾病，如帕金森?。≒arkinson disease，PD）、尿失禁、痙攣和局部性肌肉張力障礙等［1-2］。BoNT/A和BoNT/B 最常見(jiàn)的用途是在美容上，局部注射BoNT/A 或BoNT/B 是世界上最常用的非手術(shù)美容（減少皺紋的產(chǎn)生）手段。然而，大量的臨床研究表明，局部注射BoNT 會(huì)直接或間接影響到非治療的部位，嚴(yán)重的會(huì)造成肌肉癱瘓。此外，由于BoNT具有對(duì)人類(lèi)的強(qiáng)毒性，制作簡(jiǎn)單和運(yùn)輸方便等特點(diǎn)，在過(guò)去的20多年來(lái)它一直都是恐怖組織非常熱衷的生化武器之一。目前，臨床上對(duì)于BoNT 中毒的治療是基于及時(shí)診斷和使用BoNT 類(lèi)毒素疫苗和抑制性的抗體，然而這些治療手段僅限于BoNT 進(jìn)入神經(jīng)元之前。事實(shí)上，當(dāng)人們發(fā)現(xiàn)BoNT中毒時(shí)，都已發(fā)生明顯的臨床癥狀，如局部肌肉麻痹和呼吸困難等癥狀，BoNT 已進(jìn)入神經(jīng)元。目前，對(duì)于BoNT 已進(jìn)入神經(jīng)元的中毒仍無(wú)有效治療藥物。近年來(lái)，隨著對(duì)BoNT 結(jié)構(gòu)和中毒機(jī)制的深入研究，激起了人們對(duì)BoNT 抑制劑的研究［3-4］。由于小分子抑制劑相對(duì)于抗體，肽類(lèi)化合物而言，具有易得、相對(duì)穩(wěn)定、成本低和易運(yùn)輸?shù)桨悬c(diǎn)等特點(diǎn)，成為當(dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本文主要綜述近年來(lái)BoNT小分子抑制劑的研究進(jìn)展。

1 Bo NT的結(jié)構(gòu)及其引起中毒的分子機(jī)制

對(duì)于BoNT 的結(jié)構(gòu)研究已很深入，大量的文獻(xiàn)報(bào)道了BoNT 相關(guān)的晶體結(jié)構(gòu)［5-7］。對(duì)BoNT 的基因序列及晶體結(jié)構(gòu)的研究表明，BoNT/A，BoNT/B和BoNT/E 具有結(jié)構(gòu)和功能相似的結(jié)構(gòu)域，但它們結(jié)構(gòu)域的排列是不同的。所有的BoNT分子都是由一根無(wú)毒的～150 ku多肽鏈經(jīng)蛋白水解作用裂解成一根50 ku 的輕鏈（light chain，LC）和一根100 ku的重鏈（heavy chain，HC），兩者經(jīng)二硫鍵鏈接，同時(shí)由HC 伸出的一根“帶”通過(guò)非共價(jià)鍵作用環(huán)繞LC 形成完整的BoNT 分子（圖1）。LC 是BoNT 的有毒的催化結(jié)構(gòu)域（catalytic domain），是鋅肽鏈內(nèi)切酶，具有高選擇性酶切相應(yīng)的SNARE 蛋白。所有的BoNT LC的結(jié)構(gòu)具有31%～59%氨基酸序列相似性，對(duì)各自的底物有著高度的選擇性。BoNT/A和BoNT/B 選擇性的酶切（25 ku 突觸小體相關(guān)蛋白，synaptosomal-associated protein of 25 ku，SNAP-25），BoNT/E選擇性的酶切小泡相關(guān)膜蛋白（vesicleassociated membrane protein，VAMP）。HC 是使BoNT 專(zhuān)一性結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞的關(guān)鍵因素，它由2 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：N-跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)域（trans ocation domain，HCN），其主要功能是將BoNT分子跨膜遷移進(jìn)入神經(jīng)元；C端受體結(jié)合域（binding domain，HCC），其主要功能是使BoNT分子與細(xì)胞表面的受體結(jié)合。其中HCC是由2 個(gè)亞結(jié)構(gòu)域：N 端（HCCN）和C 端（HCCC）組成。HCCN的氨基酸序列在所有的BoNT分子中具有很高的相似度，其功能主要是促進(jìn)毒素與神經(jīng)元蛋白受體的高親和性結(jié)合。HCCC的主要功能是促進(jìn)與神經(jīng)元質(zhì)膜中的低親和性受體—神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)合。

圖1 A型肉毒神經(jīng)毒素（Bo NT/A）的晶體結(jié)構(gòu)（PDB entry：3BTA）及結(jié)構(gòu)域［2-3］.

在細(xì)胞水平上，所有已知的BoNT對(duì)靶細(xì)胞的作用都是通過(guò)4 個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)的：①BoNT 與神經(jīng)細(xì)胞表面的受體或具有內(nèi)吞作用的間接受體結(jié)合；②接著通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞；③硫-硫（S-S）鍵斷裂，HC 和LC 分離，由內(nèi)吞小泡酸化在膜上產(chǎn)生一個(gè)離子通道，LC由此通道從小泡轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿；④最后在胞內(nèi)由具有蛋白酶活性的LC酶切在遞質(zhì)釋放過(guò)程中起重要作用的SNARE蛋白，從而抑制突觸小泡內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放，阻斷突觸傳遞，導(dǎo)致肌肉麻痹，嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致呼吸麻痹而死亡。

2 靶向Bo NT/A 輕鏈鋅活性位點(diǎn)的小分子抑制劑

由于LC是BoNT的有毒活性部位，直接阻斷了對(duì)肌肉的神經(jīng)傳導(dǎo)，因此在藥物化學(xué)領(lǐng)域中LC 被認(rèn)為是一個(gè)非常重要的藥物靶標(biāo)蛋白。因此，最常見(jiàn)的BoNT 小分子抑制劑的篩選策略主要是以BoNT LC的活性位點(diǎn)為結(jié)合口袋，篩選可與其酶活性中心的Zn2+螯合的小分子化合物。近年來(lái)，8-羥基喹啉（quinolinol）類(lèi)化合物作為靶向BoNT/A LC的活性位點(diǎn)的小分子抑制劑受到了廣泛的關(guān)注。8-羥基喹啉片段與酶活性中心的Zn2+形成雙配位鍵，而且8-羥基喹啉類(lèi)化合物與其他金屬蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)不同，且具有相對(duì)分子質(zhì)量小、易進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造等優(yōu)點(diǎn)，方便構(gòu)效關(guān)系的深入研究，但到目前為止，仍未得到BoNT/A LC與8-羥基喹啉類(lèi)化合物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。2009 年，Roxas-Duncan等［8］以BoNT/A LC 活性位點(diǎn)為靶點(diǎn)，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接對(duì)美國(guó)國(guó)立癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）化合物庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選，結(jié)合生物活性測(cè)試得到了2個(gè)低細(xì)胞毒性的8-羥基喹啉類(lèi)小分子抑制劑1 和2（圖2），其IC50分別為1.6 和（1.86±0.25）μmol·L-1，且在Neuro-2a 細(xì)胞和體外實(shí)驗(yàn)中有效地抑制BoNT/A 對(duì)SNAP-25 的阻斷作用?；衔? 和化合物2 的衍生物3 被成功分離為一對(duì)消旋異構(gòu)體，并發(fā)現(xiàn)（+）-R-3和（-）-S-3（圖2）的IC50均約1.5 μmol·L-1。對(duì)這對(duì)對(duì)應(yīng)異構(gòu)體的分子模擬研究表明，它們與BoNT/A LC 蛋白的結(jié)合模式不同，但具有相同的結(jié)合能［9］。Caglicˇ等［10］通過(guò)對(duì)188個(gè)8-羥基喹啉類(lèi)化合物進(jìn)行篩選得到了8-羥基喹啉類(lèi)小分子抑制劑4（圖2），其IC50為0.9 μmol·L-1，該分子在細(xì)胞水平表現(xiàn)出了良好的抑制活性，且細(xì)胞毒性較低，水溶性好。并對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)4 在大鼠和人的肝微粒體中的半衰期分別為20.3 和116.0 min，而在血清中的半衰期分別為98.5和92.2 min。Minnow等［11］通過(guò)動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)證明了8-羥基喹啉類(lèi)化合物5（MSU58）和6（MSU84）（圖2）是BoNT/A LC的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其IC50分別為（3.3±0.3）μmol·L-1和（5.8±2.3）μmol·L-1。同年，Bremer 等［12］報(bào)道合成了一系列8-羥基喹啉類(lèi)化合物并對(duì)其構(gòu)效關(guān)系（structure activity relationship，SAR）進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)5-磺?；?-氨基取代的8-羥基喹啉類(lèi)化合物7-10（圖2）對(duì)BoNT/A LC 的Ki＜1 μmol·L-1，其中化合物7 和9 在細(xì)胞水平上有效地抑制了BoNT/A LC 對(duì)SNAP-25 的切斷，有效地緩解了BoNT/A對(duì)肌肉的麻痹。

圖2 靶向Bo NT/A輕鏈鋅活性位點(diǎn)的8-羥基喹啉類(lèi)小分子抑制劑［8-12］

異羥肟羧酸類(lèi)化合物也是研究較多的一類(lèi)BoNT/A LC 小分子抑制劑。Boldt等［13］通過(guò)高通量篩選并對(duì)先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到了2，4-二氯本丙烯酰異羥肟酸11（圖3），其IC50值為（0.41±0.03）μmol·L-1，Ki值為（0.3±0.012）μmol·L-1。并得到了第一個(gè)BoNT/A LC與小分子復(fù)合物的晶體：BoNT/A LC-11復(fù)合物，對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)分析表明，11結(jié)合于酶的活性位點(diǎn)，異羥肟酸片段取代了起催化作用的水分子，其羥基氧原子與鋅離子結(jié)合［14］?；谶@些信息，一系列靶向BoNT/A LC活性位點(diǎn)的的異羥肟羧酸類(lèi)小分子抑制劑被報(bào)道。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到了11 的類(lèi)似物12 和13（圖3），其IC50值分別為（0.69±0.05）μmol·L-1和（0.56±0.15）μmol·L-1［15-16］。Stowe等［17］報(bào)道合成了手性化合物R-14（圖3），其Ki值為（0.16±0.02）μmol·L-1。通過(guò)對(duì)BoNT/A LC 與R-14 復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)分析，得出結(jié)論：分子手性是得到潛在高活性的BoNT/A LC活性位點(diǎn)抑制劑的關(guān)鍵。此外，將金剛烷片段引入11 中取代其芳香基團(tuán)，得到了化合物15（圖3），其IC50值為（0.46±0.08）μmol·L-1［18］?；趯?duì)BoNT/A LC與化合物15復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)分析指導(dǎo)進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到了P-氯-苯基取代的化合物16（圖3），其IC50值為（0.027±0.004）μmol·L-1，是目前該類(lèi)化合物中對(duì)BoNT/A LC 抑制活性最好的化合物［19］。Thompson 等［20］報(bào)道研究了異羥肟羧酸類(lèi)小分子化合物與BoNT/A LC復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，其中活性最好的小分子化物17（圖3），其IC50值為4.6 μmol·L-1。研究表明，在BoNT/A LC 與小分子化合物形成復(fù)合物后，BoNT/A LC的活性位點(diǎn)空腔發(fā)生了明顯的變化，而且在活性位點(diǎn)空腔口的60/70 回彎處構(gòu)象變化最大。綜上所述，雖異羥肟羧酸類(lèi)小分子化合物與BoNT/A LC 的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)已有報(bào)道并有效地指導(dǎo)該類(lèi)小分子化合物的SAR 改造，有些異羥肟羧酸類(lèi)化合物對(duì)BoNT/A LC有較好的抑制活性，然而該類(lèi)化合物具有高溶劑化特點(diǎn)，使得其口服吸收和透膜性都較差。因此，通過(guò)對(duì)該類(lèi)化合物前藥的研究或許可找到類(lèi)藥性較好的BoNT/A LC小分子抑制劑。

圖3 靶向Bo NT/A輕鏈鋅活性位點(diǎn)的異羥肟羧酸類(lèi)小分子抑制劑［13-20］.

3 與BoNT/A輕鏈共價(jià)結(jié)合的不可逆小分子抑制劑

2010年，Capková等［21］首次報(bào)道了與BoNT/A LC共價(jià)鍵結(jié)合的不可逆小分子抑制劑18（圖4），該化合物是基于異羥肟羧酸類(lèi)化合物11的結(jié)構(gòu)改造得到的，其對(duì)SNAP-25抑制的Kinact/Ki=520 M-1s-1，與基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloprotease，MMP，MMP與BoNT/A LC結(jié)構(gòu)相近）相比，化合物18對(duì)BoNT/A LC具有較高的選擇性。采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）對(duì)包含70 000個(gè)化合物的化合物庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，得到了通過(guò)共價(jià)鍵鏈的高選擇性BoNT/A LC的小分子抑制劑苯并咪唑取代的丙烯腈類(lèi)化合物19（圖4），其對(duì)SNAP-25抑制的Kinact/Ki=979 M-1s-1，IC50=7.2 μmol·L-1。對(duì)化合物19作進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改造得到了化合物20（圖4），其對(duì)抑制SNAP-25 斷裂 的Kinact/Ki=326 M-1s-1，IC50=7.2 μmol·L-1?；衔?0在雞神經(jīng)細(xì)胞中有效地抑制了BoNT/A LC對(duì)SNAP-25的切割作用［22-23］。

圖4 與Bo NT/A輕鏈共價(jià)結(jié)合的不可逆小分子抑制劑［21-23］.

4 靶向Bo NT/A 輕鏈Exosite的小分子非競(jìng)爭(zhēng)抑制劑

圖5 靶向BoNT/A輕鏈外接位點(diǎn)的小分子抑制劑[25-28].

Breidenbach 等［24］首次報(bào)道了在BoNT/A LC活性位點(diǎn)周?chē)€存在另外2個(gè)結(jié)合口袋α-外接位點(diǎn)和β-外接位點(diǎn)，這一發(fā)現(xiàn)提供了抑制BoNT/A LC活性的新靶點(diǎn)。α-外接位點(diǎn)位于BoNT/A LC 活性位點(diǎn)的背面，由4個(gè)螺旋組成，是底物特異性的決定性因素；β-外接位點(diǎn)位于BoNT/A LC活性位點(diǎn)附近的動(dòng)態(tài)回彎區(qū)，它對(duì)于底物的特異性作用不大，但由于它與底物SNAP-25 之間通過(guò)3 條反平行的β-折疊相互作用，因此，β-外接位點(diǎn)是決定底物的活性關(guān)鍵因素。Silhár 等［25］通過(guò)高通量篩選得到了第一個(gè)α-外接位點(diǎn)小分子抑制劑天然產(chǎn)物D-菊苣酸（Dchicoric acid）21（圖5），其Ki=0.7 μmol·L-1。同年該小組高通量篩選約翰·霍普金斯臨床化合物庫(kù)（Johns Hopkins Clinical Compound Library，其中包含1500 個(gè)已知藥物）得到了第一個(gè)β-外接位點(diǎn)的小分子抑制劑天然產(chǎn)物洛莫真菌素22（Lomofungin）（圖5），其Ki=（6.7±0.7）μmol·L-1。21和22分別與羥肟酸類(lèi)活性中心抑制劑11 都有協(xié)同抑制作用，此外，21，22和113者之間也表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用［26］。接下來(lái)，Bremer等［27］對(duì)洛莫真菌素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，得到了活性更高的β-外接位點(diǎn)小分子抑制劑CBIP 23（圖5），其IC50=2.9 μmol·L-1。Hu等［28］采用副本交換分子動(dòng)態(tài)模擬法（replica-exchange molecular dynamic simulation，REMD simulation）得到了到迄今活性最好的小分子抑制劑24（圖5），其Ki=0.09 μmol·L-1，IC50=（0.5±0.2）μmol·L-1。圖5靶向BoNT/A LC外接位點(diǎn)的小分子抑制劑［25-28］。

5 Bo NT/A的其他類(lèi)型的小分子抑制劑

抑制BoNT/A 中毒的另外一種途徑就是抑制BoNT/A 進(jìn)入到神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)。BoNT/A 進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞主要是通過(guò)發(fā)動(dòng)蛋白（dynamin）的內(nèi)吞途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Harper 等［29］報(bào)道了發(fā)動(dòng)蛋白抑制劑Dyngo-4a 25（圖6）具有抑制BoNT/A 進(jìn)入到海馬神經(jīng)元，而且在小鼠模型中可延遲BoNT/A中毒。Seki 等［31］基于25中的多酚羥基片段與21結(jié)構(gòu)相似性，通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出25除可抑制BoNT/A進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞，同時(shí)還可靶向α-外接位點(diǎn)和β-外接位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制BoNT/A LC 的活性，其IC50=（6.25±1.02）μmol·L-1。盡管細(xì)胞水平上的實(shí)驗(yàn)（hiPSCa神經(jīng)元細(xì)胞）表明25主要是抑制BoNT/A 進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞，然而小鼠實(shí)驗(yàn)則表明25 對(duì)BoNT/A LC 蛋白酶的抑制作用，化合物25 是第一個(gè)BoNT/A 的多靶點(diǎn)藥物［30］他們通過(guò)細(xì)胞水平活性篩選，得到了琥珀酰亞胺類(lèi)BoNT/A 抑制劑26（圖6），其EC50=4.9 μmol·L-1。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，化合物26是通過(guò)靶向抑制硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）的自殺底物抑制機(jī)制，從而抑制了BoNT/A 遷移進(jìn)入細(xì)胞。由于所有的BoNT 都要在TrxR 的輔助作用下遷移進(jìn)入細(xì)胞，因此基于化合物26 的作用機(jī)制，將會(huì)得到對(duì)所有BoNT都有抑制作用的小分子抑制劑。

圖6 靶向Bo NT/A輕鏈的其他類(lèi)型小分子抑制劑［29-31］.

6 靶向Bo NT/B 輕鏈與Bo NT/E 輕鏈的小分子抑制劑

相對(duì)于BoNT/A，對(duì)BoNT/B 與BoNT/E 的小分子抑制劑的研究報(bào)道較少。目前仍然無(wú)可用于臨床治療的BoNT/B 和BoNT/E 引起中毒的小分子抑制劑。BoNT/B選擇性地在Gln76和Phe77之間酶切底物VAMP。Adler 等［32］在缺乏BoNT 的單晶衍射的數(shù)據(jù)的情況下，于1998年報(bào)道了最早的BoNT/B LC小分子抑制劑：27（ICD1578）（圖7），其IC50是27.6 μmol·L-1，27 最初設(shè)計(jì)為MPP 抑制劑。鋅離子螯合劑28（BABIM）（圖7）對(duì)BoNT/B LC 的抑制作用較弱（IC50=5～10 μmol·L-1）。對(duì)比BoNT/B LC和28-BoNT/B 的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在28-BoNT/B LC 的復(fù)合物中，有2 分子的28 與BoNT/B LC 活性中心的鋅離子螯合，其中一個(gè)28 進(jìn)入轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域和催化域之間的縫隙內(nèi)，而另一個(gè)28位于轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域和受體結(jié)合域之間。從這些復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，在抑制劑作用下活性位點(diǎn)的微環(huán)境發(fā)生了變化，起催化作用的鋅從活性位點(diǎn)跑到了蛋白的其他位置［33］。

圖7 靶向Bo NT/B輕鏈的小分子抑制劑［32-33］

與其他血清型BoNT相比，BoNT/E中毒速度最快，它專(zhuān)一性地在Arg180 和Ile181 之間切割底物SNAP25。Agarwal等［34］報(bào)道了BoNT/E LC活性中心的晶體結(jié)構(gòu)及其與底物類(lèi)似物抑制劑（SNAP-25的衍生物）RIME 的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。該小組使用這些晶體結(jié)構(gòu)，通過(guò)基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)虛擬篩選及HPLC 的測(cè)試法于2012 年首次報(bào)道了BoNT/E LC 的小分子抑制劑：芴類(lèi)化合物29〔Ki=1.29 μmol·L-1，IC50=（48.5±6.5）μmol·L-1〕（圖8）。根據(jù)化合物29 與BoNT/E 的活性中心的分子對(duì)接模式可見(jiàn)，與BoNT/E LC-RIME 作用模式類(lèi)似，苯甲酸中的C=O與Zn螯合并與Tyr350形成氫鍵［35］。在此基礎(chǔ)上以芴為藥效團(tuán)，該小組得到了活性和結(jié)構(gòu)與29相近的化合物30-33（圖8）［36］。Zhou等［37］采用相同的策略，基于與肽類(lèi)抑制劑RIME的‘足跡相似性’（footprint similarity，F(xiàn)PS）篩選，得到了目前為止活性最好的BoNT/E LC 小分子34（圖8），其IC50為（14.2±1.7）μmol·L-1，比29 活性強(qiáng)3 倍。根據(jù)化合物34 與BoNT/E 的活性中心的分子對(duì)接模式可見(jiàn)，與BoNT/E LC-RIME作用模式類(lèi)似。

7 結(jié)語(yǔ)與展望

根據(jù)BoNT 對(duì)靶細(xì)胞的作用的4 個(gè)步驟，人們提出了治療BoNT中毒的不同策略，主要包括以下幾種：①抑制BoNT通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞，如發(fā)動(dòng)蛋白抑制劑Dyngo-4a 25［30］；②通過(guò)靶向TrxR抑制S-S鍵的斷裂，該策略可得到對(duì)所有BoNT都有抑制作用的小分子抑制劑［31］；③靶向BoNT LC 的小分子抑制劑；④多靶點(diǎn)小分子抑制劑［30］。

由于BoNT 通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞，并在TrxR催化作用下的S-S鍵斷裂得到LC和HC的速度很快，限制了該類(lèi)小分子抑制劑使用的時(shí)效性。此外，BoNTLC 進(jìn)入到胞漿后穩(wěn)定性好，半衰期長(zhǎng)，還可高選擇性地酶切SNARE蛋白，從而導(dǎo)致較長(zhǎng)時(shí)期的BoNT中毒。因此，靶向BoNT LC的小分子抑制劑是治療BoNT中毒的有效策略。但由于BoNT LC 是鋅肽鏈內(nèi)切酶，它與底物（SNAP-25 或VAMP）之間的作用模式非常復(fù)雜，具有結(jié)合位點(diǎn)多（鋅活性位點(diǎn)，α-外接位點(diǎn)和β-外接位點(diǎn)等），結(jié)合口袋的柔性和空腔大等特點(diǎn)，因此，BoNT 的LC 是一個(gè)很難靶向的靶點(diǎn)。目前，BoNT/A LC的小分子抑制劑的研究最多，其次是BoNT/B/E。8-羥基喹啉類(lèi)和異羥肟羧酸類(lèi)是目前研究較為深入的BoNT/A LC 的鋅活性位點(diǎn)小分子抑制劑，有些已達(dá)到nmol級(jí)活性。但他們的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)較差，即藥物的吸收，分布，代謝，排泄和毒性（absorption，distribution，metabolism，excretion，toxicity，ADMET）。對(duì)于以口服或注射方式給藥的肉毒神經(jīng)毒素小分子抑制劑，首先，最重要的是有足夠的小分子抑制劑到達(dá)并進(jìn)入到靶向的神經(jīng)細(xì)胞，如對(duì)于BoNT/A LC的小分子抑制劑，當(dāng)其體外的神經(jīng)細(xì)胞抑制活性＞90%時(shí)，才會(huì)在動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中有效地抑制BoNT 中毒。文獻(xiàn)報(bào)道的很大一部分BoNT LC 的小分子抑制劑的透膜性，類(lèi)藥性較差，不能進(jìn)入靶向的神經(jīng)細(xì)胞，而對(duì)于可進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞的BoNT LC的小分子抑制劑的體外實(shí)驗(yàn)的抑制活性和藥物耐受性較差，對(duì)其ADMET的研究不足。此外，肉毒神經(jīng)毒素在血液中是很穩(wěn)定的，其主要靶向膽堿神經(jīng)末梢（運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元）細(xì)胞并迅速進(jìn)入該細(xì)胞而不會(huì)在其他細(xì)胞或組織內(nèi)聚集。因此，提高小分子化合物在神經(jīng)細(xì)胞中抑制BoNT/A LC，降低其對(duì)其他細(xì)胞和組織的毒性以及提高其藥動(dòng)學(xué)ADMET性質(zhì)，是決定這些化合物能否進(jìn)入臨床使用的關(guān)鍵因素。

圖8 靶向Bo NT/E輕鏈的小分子抑制劑［34-37］.

此外，人們又提出了多靶點(diǎn)的策略［30］。如化合物Dyngo-4a 25（圖6），靶向BoNT對(duì)靶細(xì)胞作用的2 個(gè)階段，即抑制了BoNT/A 進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞，同時(shí)還可靶向α-外接位點(diǎn)和β-外接位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制BoNT/A LC的活性，并在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)上都得到了證實(shí)。由于Dyngo-4a 25 的活性較低，不能有效地抑制BoNT 中毒，而且對(duì)其ADMET 研究不足。該策略無(wú)疑是一種有效抑制BoNT 中毒的有效手段，相信提高該多靶點(diǎn)的小分子抑制劑的活性及其ADMET性質(zhì)，一定可得到抑制BoNT中毒的有效治療手段。

BoNT 作為世界上已知的最致命毒素之一，是人類(lèi)健康和生命的潛在威脅。目前，美國(guó)FDA批準(zhǔn)的用于BoNT 中毒治療的主要手段僅適用于BoNT進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞前的抗體治療法，或?qū)τ谟袧撛贐oNT 中毒風(fēng)險(xiǎn)的人群使用疫苗。然而對(duì)于BoNT已進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞的患者仍然無(wú)臨床可用的解毒手段。近年來(lái)，隨著對(duì)BoNT 相關(guān)晶體結(jié)構(gòu)的解析和對(duì)其作用機(jī)制的深入研究，以及高通量篩選的測(cè)試手段的發(fā)展，加速了BoNT 抑制劑的研究。迄今雖仍然無(wú)可進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)的BoNT 小分子抑制劑，但有些化合物已具有較好的細(xì)胞水平上的和一定的動(dòng)物水平上的抑制活性。相信在不久的將來(lái)，BoNT小分子抑制劑的研發(fā)將會(huì)取得突破性的進(jìn)展。