陳 茜，張長城，韓貴芳，馬 娜，袁 丁，趙海霞

（1.三峽大學醫(yī)學院，湖北宜昌443002；2.三峽大學仁和醫(yī)院，湖北宜昌443001）

隨著社會發(fā)展，受職業(yè)規(guī)劃和對生活水平要求增加等因素影響，人類平均生育年齡不斷增加，因此有生育需求的中老年男性亦不斷增加［1-2］。臨床研究發(fā)現(xiàn)［3-4］，隨著年齡的不斷增長，男性睪丸生殖功能逐漸減退，精子數(shù)量與質量均顯著下降，導致生育能力下降和生殖缺陷的上升［5］。睪丸支持細胞（Sertoli 細胞）是維持各級生精細胞功能的基礎細胞，其在精子的形成過程中起著至關重要的作用。研究已證實［6-7］，睪丸Sertoli細胞功能衰退是衰老所致生殖功能減退的重要原因。淫羊藿是小檗科植物淫羊藿屬（Epimedium）干燥葉，為我國傳統(tǒng)補益中藥。現(xiàn)代藥理學研究顯示［8］，淫羊藿具有抗衰老和增強雄性生殖功能等藥理作用，其主要活性成分為淫羊藿總黃酮（total flavones of Epimedium，TFE）。另有研究報道，TFE能明顯增加雄性老年大鼠血清中卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成素（luteinising hormone，LH）、睪酮（testosterone，T）和雌激素的含量［9］，增加D-半乳糖致亞急性衰老雄性大鼠睪丸內精子數(shù)目，明顯改善睪丸組織的退行性改變，減輕亞急性衰老大鼠睪丸損傷［10］。但TFE 是否能改善自然衰老大鼠睪丸Sertoli細胞分泌功能衰退進而延緩衰老所致生殖功能障礙，目前尚不明確，其機制有待進一步研究。因此，在本研究中采用自然衰老大鼠為模型，研究TFE對衰老大鼠睪丸Sertoli細胞分泌功能衰退的改善作用并探討其機制，為闡明TFE用于臨床防治中老年男性生殖功能衰退和生育障礙提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

TFE 購自成都仁誠生物科技有限公司，其含量為80%，用1%羧甲基纖維素鈉溶液溶解并配成相應濃度的溶液?？俁NA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒（大連寶生物科技有限公司）；PCR 引物［生工生物工程（上海）股份有限公司合成］；RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF）、磷酸蛋白酶抑制劑（武漢谷歌生物有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）；ECL顯影液（上海碧云天生物技術研究所）；兔抗人β 肌動蛋白（單抗4970L）購自美國Cell Signaling Technology公司；小鼠抗人SOX9單抗（AB55350）購自美國Millipore 公司；小鼠抗人SCF 單抗（SC-13126），小鼠抗人GDNF 單抗（SC-13147）購自Santa Cruz公司；兔抗人BMP4單抗（ab39973），兔抗人p-IRE1α 單抗（ab48187），兔抗人XBP1 多抗（ab37152）購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗小鼠IgG、HRP 標記的山羊抗兔二抗購自武漢科瑞有限公司。IX53 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司），A1R+型共聚焦激光顯微鏡（日本Nikon公司），StepOne Plus 型實時定量PCR 儀（美國Applied Biosysterms 公司），TYPE1500-458 型全波長酶標儀（美國Thermo公司），PowerPac200型Western Blot電泳儀（美國Bio-Rad公司），Bioshine ChemiQ4800型化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（上海歐翔科學儀器有限公司）。

1.2 動物和分組

SPF 級 雄 性18 月 齡SD 大 鼠36 只、2 月 齡10 只（實驗動物使用許可證號SCXK［鄂］2011-0012，三峽大學醫(yī)學院實驗動物中心），分籠飼養(yǎng)于該實驗動物中心SPF 級屏障系統(tǒng)，屏障內保持濕度55%～65%，溫度（18～22）℃，控制光照，每天12 h 明暗交替，標準顆粒飼料飼養(yǎng)，不限攝食與飲水。將36只18月齡大鼠隨機分為3組，每組12只，即自然衰老組、TFE 10和40 mg·kg-1組，10只2月齡大鼠為壯齡對照組。每天定時ig 給予1次，每5 d間隔2 d 再繼續(xù)ig 給藥，給藥共計4 個月。每周測量一次大鼠體質量，根據(jù)體質量調整TFE的灌胃量，壯齡對照組和自然衰老組大鼠則等體積灌胃1%CMC-Na溶液。期間，自然衰老組和TFE 40 mg·kg-1組大鼠死亡各3只，TFE 10 mg·kg-1組死亡4只，壯齡對照組1只出現(xiàn)不明原因消瘦。給藥結束時，各組大鼠存活情況為：壯齡對照組9只，自然衰老組9只，TFE 10 mg·kg-1組8只；TFE 40 mg·kg-1組9只。

1.3 計算睪丸指數(shù)

將各組大鼠分別置天平上稱得體質量后麻醉大鼠，摘取左右睪丸，測量兩側睪丸的平均質量，計算睪丸指數(shù)。睪丸指數(shù)=兩側睪丸的平均質量（mg）/大鼠體質量（g）。

1.4 HE染色觀察睪丸組織形態(tài)

取各組大鼠睪丸石蠟切片置染色架，60℃烘箱中置4 h 直到切片上的石蠟融化為液體，迅速放入二甲苯中開始脫蠟然后經不同濃度乙醇梯度洗脫，經蘇木素-伊紅（HE）染色最后置梯度乙醇及二甲苯脫水透明后封片，于光學顯微鏡下取圖觀察組織形態(tài)變化。

1.5 實時定量PCR檢測Sertoli細胞GDNF，BMP4和SCF mRNA表達水平

稱取約60 mg睪丸組織，加1 mL Trizol裂解液充分裂解。根據(jù)總RNA 提取試劑盒提取總RNA，核酸檢測儀測定所提取的總RNA 濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，經逆轉錄試劑盒得模板c DNA，于-20℃保存?zhèn)溆?。擴增時使用β肌動蛋白作為內參，反應體系總體積為10 μL：SYBR Green 5 μL，模板c DNA 2 μL，無RNA 酶無菌水（RNase free water）2.4 μL，Dye 0.2 μL，分別加入0.4 μL GDNF、BMP4、SCF 和β 肌動蛋白引物（上下游各0.2 μL），引物序列見表1，敲打混勻后依次加入排管，最后每管加稀釋10倍的模板c DNA 2 μL后離心，上機（ABI StepOne plus real-time PCR system）進行擴增，操作過程中注意避光。qPCR擴增參數(shù)：預變性95℃，20 s；94℃變性，退火溫度60℃，共40個循環(huán)。擴增結束后讀取CT值，2-ΔΔCT計算mRNA相對表達量。

Tab.1 Sequence of primers

1.6 Western 印跡法檢測睪丸組織內GDNF，BMP4，SCF，p-lRE1α和XBP1蛋白表達

稱取約60 mg 睪丸組織并加入300 μL 裂解液（RIPA裂解液∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制劑=100∶1∶1）于勻漿管中，經勻漿儀高速研磨30 s，吸取液體置于渦旋儀上充分振蕩約15 s，在冰上靜置5 min，重復此步驟3 次，然后4℃下13 523×g，離心10 min后取上清，根據(jù)BCA 工作液進行蛋白定量，加入上樣緩沖液煮沸滅活10 min。電泳并轉印至PVDF膜、封閉1 h，加入一抗〔GDNF（15 ku）1∶1000，BMP4（47 ku）1∶1000，SCF（45 ku）1∶1000，p-IRE1α（110 ku）1∶1000，XBP1（29 ku）1∶1000〕4℃過夜，洗膜，室溫下二抗孵育1 h，洗膜顯影。采用Image pro plus 6.0 對目的蛋白條帶進行積分吸光度（integrated absorbance，IA）分析。待測蛋白相對表達水平用IA目標蛋白/IA 內參蛋白比值表示。

1.7 免疫熒光檢測大鼠睪丸組織內Sertoli 細胞數(shù)量和p-lRE1α定位

將睪丸石蠟切片置60℃烘箱烘烤4 h，經二甲苯脫蠟與梯度乙醇洗脫，檸檬酸修復液進行抗原修復，5%BSA 室溫封閉1 h，一抗（SOX9 小鼠單抗1∶600，p-IRE1α 兔單抗1∶200），4℃孵育過夜，熒光二抗（1∶200）室溫避光孵育1 h，棄二抗，PBS 洗滌5 次，每次5 min，最后滴加DAPI 避光染色10 min，洗去DAPI 使用抗熒光淬滅封片劑進行封片，共聚焦激光顯微鏡下觀察采集圖像。每組選擇3 個標本，每個標本選擇3個圖像視野，利用Image J軟件統(tǒng)計各組SOX9 陽性灶點數(shù)表示Sertoli 細胞數(shù)，綠色熒光表示p-IRE1α定位。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 TFE 對自然衰老大鼠睪丸質量及睪丸指數(shù)的影響

與壯齡對照組比較，自然衰老組大鼠睪丸質量有所降低，但無統(tǒng)計學差異，睪丸指數(shù)顯著降低（P＜0.01）（表2）；與自然衰老組比較，TFE 40 mg·kg-1組睪丸指數(shù)顯著升高（P＜0.05）。

2.2 TFE對自然衰老大鼠睪丸組織形態(tài)的影響

結果如圖1 所示，壯齡對照組睪丸生精小管內各級生精細胞可見且結構完整，呈緊密規(guī)則分布。自然衰老組大鼠部分生精細胞從生精上皮脫落，與壯齡對照組比較，生精細胞數(shù)目明顯減少，且生精小管萎縮，小管間間隙增大。而給予TFE 后，TFE用藥組大鼠睪丸生精小管的形態(tài)結構均有明顯改善。

Tab.2 Effect of total flavonoids of Epimedium（TFE）on testicular mass and testicular index in natural aging rats

Fig.1 Effect of TFE on morphology of testis tissue in natural aging rats（HE staining）. See Tab.2 for the rat teratment. Arrows show the structural disorder of spermatogenic cells at all levels，and the phenomenon of cell shedding in some spermatogenesis.

2.3 TFE對自然衰老大鼠睪丸組織內GDNF，BMP4和SCF mRNA水平的影響

與壯齡對照組相比，自然衰老組大鼠睪丸組織中分泌因子GDNF 和SCF mRNA 表達顯著降低（P＜0.01），與自然衰老組相比，TFE用藥后GDNF，BMP4 和SCF mRNA 表達明顯上調（P＜0.05，P＜0.01）（表3）。

Tab.3 Effect of TFE on levels of GDNF，BMP4 and SCF mRNA in testis of natural aging rats

2.4 TFE 對自然衰老大鼠睪丸內GDNF，BMP4 和SCF蛋白表達的影響

Western 印跡結果（圖2）表明，與壯齡對照組相比，自然衰老組大鼠睪丸組織中分泌因子GDNF，BMP4 和SCF 蛋白表達均顯著減少（P＜0.01），與自然衰老組相比，TFE組GDNF，BMP4和SCF蛋白表達顯著增加（P＜0.01）。

2.5 TFE對衰老大鼠睪丸組織內p-lRE1α和XBP1蛋白表達

與壯齡對照組相比，自然衰老組大鼠睪丸組織中p-IRE1α 和XBP1 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01），給予TFE 后上述蛋白的表達顯著增加（P＜0.01）（圖3）。

2.6 TFE對衰老大鼠睪丸組織內Sertoli細胞數(shù)量和p-lRE1α表達定位的影響

免疫熒光結果（圖4）顯示，SOX9（紅色熒光）陽性表達位于生精小管近基底膜部位，壯齡對照組、自然衰老組和TFE處理組各組間SOX9陽性灶點數(shù)未見明顯差異，且熒光強度相近，提示各組間Sertoli細胞數(shù)量無顯著差異（圖據(jù)未顯示）。p-IRE1α（綠色熒光）在睪丸組織內各級生精細胞及支持細胞胞質中廣泛定位表達，各組間表達定位無顯著差異。

Fig.2 Effect of TFE on expression of GDNF（A，D），BMP4（B，E）and SCF（C，F(xiàn)）in natural aging rats by Western blotting. See Tab.2 for the rat treatment.D，E and F were the semi-quantitative results of A，B and C，respectively.x±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with young control group；##P＜0.01，compared with natural aging control（0）group.

Fig.3 Effect of TFE on expression levels of inositol-requiring enzyme 1α（p-lRE1α）and X-box-binding protein 1（XBP1）in testis of natural aging rats by Western blotting. See Tab.2 for the rat treatment.C and D were the semi-quantitative results of A and B，respectively. x±s，n=4. ＊＊P＜0.01，compared with young control group；##P＜0.01，compared with natural aging control（0）group.

Fig.4 Effect of TFE on number of sertoli cells（A）and localization and expression of p-lRE1α protein in testis tissue（B）of natural aging rats observed by laser scanning confocal microscopy. See Tab.2 for the rat treatment. Arrows show sertoli cells（A）and p-IRE1α in spermatogenic cells and sertoli cells at all levels in the testis tissue（B）.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，自然衰老組大鼠睪丸指數(shù)降低，且出現(xiàn)生精小管萎縮，小管間間隙增大，生精上皮脫落，各級生精細胞排列紊亂的現(xiàn)象，而給予TFE用藥后其組織形態(tài)結構明顯恢復。提示TFE能改善衰老所致睪丸組織形態(tài)的退行性改變。

Sertoli 細胞是生精小管內唯一直接與生精細胞接觸的體細胞，在精子生成過程中起著至關重要的作用［11］。有文獻報道，SOX9 在哺乳動物睪丸Sertoli 細胞中持續(xù)表達，可作為其特異性標志物［12-13］。因此，我們利用SOX9 標記Sertoli 細胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)狀齡對照組、自然衰老組和TFE 用藥組中SOX9 的陽性表達差異不明顯。此結果表明，各組間Sertoli 細胞數(shù)量無明顯變化，提示增齡過程中Sertoli 細胞功能下降可能是引起睪丸生殖能力減退的重要原因。

在睪丸組織中，Sertoli細胞的功能主要是通過分泌GDNF，BMP4 和SCF 等多種因子來促進精原干細胞的增殖與分化，調控精子發(fā)生［14-16］。GDNF對維持精原干細胞自我更新具有非常重要的作用，而BMP4 和SCF 則是調控精原干細胞分化的關鍵因子。本課題組前期研究已證實，TFE能上調隱睪小鼠復位固定后睪丸內Sertoli 細胞分泌因子GDNF和SCF等表達［17］。本研究結果也顯示，TFE能上調自然衰老大鼠睪丸Sertoli 細胞分泌因子GDNF，BMP4 和SCF 的mRNA 和蛋白表達水平，說明TFE 能有效改善自然衰老大鼠Sertoli 細胞的分泌功能。

有研究表明，IRE1α/XBP1 信號通路能調節(jié)參與蛋白質折疊、成熟、轉運和降解等多個過程的一系列靶基因，進而維持細胞功能和延緩細胞衰老［18-20］。另有研究報道，該信號通路對睪丸生殖功能有重要的調節(jié)作用，其失活與生殖功能減退直接相關［21-22］。本研究結果顯示，p-IRE1α 不僅在生精細胞胞質內廣泛表達，同時在Sertoli細胞胞質內亦有表達。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)與壯齡對照組相比，自然衰老大鼠睪丸組織內p-IRE1α和XBP1蛋白表達均顯著減少，而TFE 能顯著增加上述蛋白的表達。結果表明TFE 能增加自然衰老大鼠睪丸組織內p-IRE1α的表達。

綜上所述，TFE 能改善自然衰老大鼠Sertoli 細胞分泌功能，其機制可能是通過調節(jié)IRE1α/XBP1信號通路，增強Sertoli 細胞內p-IRE1α的活性來實現(xiàn)的。這為后續(xù)臨床研究TFE 防治衰老所致男性生殖功能障礙提供一定的實驗基礎。