蘭秀華，謝麗源*，許瀛引，彭衛(wèi)紅，甘炳成

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2.電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，信息生物學(xué)研究中心，四川 成都 610054）

羊肚菌（Morchella spp.），隸屬子囊菌門（Ascomycota）、盤菌綱（Pezizomycetes）、羊肚菌科（Morchellaceae），羊肚菌屬（Morchella）[1]，是一種珍稀名貴食（藥）用菌，由于其菌蓋表面有不規(guī)則多面凹陷皺褶似羊肚而得名。羊肚菌味道鮮美，肉質(zhì)脆嫩可口，風(fēng)味獨(dú)特，是食（藥）用菌中的珍品之一，自古以來一直被奉為宴席上的美味佳肴。除此之外，羊肚菌營養(yǎng)豐富，含有多糖、生物酶類以及鈣、鋅、鐵等多種礦物質(zhì)[2-3]。已有醫(yī)學(xué)研究表明，羊肚菌有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗疲勞、抑制腫瘤、抗菌、抗病毒、降血脂、抗氧化等功效[4-12]。

近年來，羊肚菌馴化栽培技術(shù)得到迅猛發(fā)展，課題組通過10多年努力，選育了國內(nèi)外首個羊肚菌新品種，集成了羊肚菌配套栽培技術(shù)研究，率先實現(xiàn)了羊肚菌大田商業(yè)化栽培，為羊肚菌市場提供商品來源。隨著羊肚菌人工栽培技術(shù)日益成熟，羊肚菌品種日益增多，目前對羊肚菌品種選育大多以外觀作為品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，以產(chǎn)量作為品種選育指標(biāo)，并以此來指導(dǎo)生產(chǎn)。羊肚菌中含有獨(dú)特的香氣物質(zhì)，它是賦予羊肚菌風(fēng)味的關(guān)鍵因子，也是衡量其品質(zhì)和品種選育的重要指標(biāo)。目前國內(nèi)外對于羊肚菌研究主要集中在菌株生物學(xué)特性[13-16]、深層發(fā)酵工藝優(yōu)化[17-18]、多糖提取及純化[19-22]、種質(zhì)資源與遺傳多樣性[23-27]以及生物活性[28]等方面，關(guān)于羊肚菌香氣物質(zhì)及品質(zhì)區(qū)分方面的研究鮮有報道。

揮發(fā)性物質(zhì)目前可通過感官評價、主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析（cluster analysis，CA）進(jìn)行分析鑒定和分類研究。感官評價方式存在極大的人為因素影響，而PCA和CA是近些年用于樣品之間區(qū)別和聚集最普遍的方式。利用PCA和CA進(jìn)行羊肚菌品質(zhì)的綜合評價，可避免單一指標(biāo)的片面性和不穩(wěn)定性，為樣品的利用和品質(zhì)育種提供重要的科學(xué)依據(jù)。

本實驗采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）法檢測20 個樣品揮發(fā)性物質(zhì)，分析揮發(fā)性物質(zhì)特性，并對揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量進(jìn)行PCA和CA，旨在為品種選育和后期生產(chǎn)加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

20 個羊肚菌子實體，編號為樣品1～20，均為梯棱羊肚菌（Morchella importuna）由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所2017年馴化栽培，于同一栽培地點(diǎn)、同一管理栽培模式、同一時期采收樣品，經(jīng)過挑選、烘干，粉碎后密封待用。

1.2 儀器與設(shè)備

7890-5975 GC-MS聯(lián)用儀（配有電子電離源）美國Agilent公司；65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取纖維頭 美國Supelco公司；Atomx動態(tài)頂空自動進(jìn)樣器 美國Teledyne Tekmar公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME

將粉碎后的樣品混合均勻，稱取2.00 g試樣放置在10 mL樣品瓶中，加入1.5 g NaCl和6 mL經(jīng)過煮沸冷卻的蒸餾水，搖勻，然后將溶液置于15 mL頂空瓶中，將老化后的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于50 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入GC進(jìn)樣口，于250 ℃解吸3 min，用于GC-MS分析檢測。

1.3.2 GC-MS條件

DB-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.50 μm）；載氣：高純氦氣；載氣流速（恒流模式）：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣；分流比：10∶1；升溫程序：35 ℃不保持，以5 ℃/min速率升溫至220 ℃，保持10 min；離子源溫度：230 ℃；掃描模式：Scan；質(zhì)量掃描范圍45～350 u；接口溫度：230 ℃；

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 22.0對羊肚菌揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行PCA和CA。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同羊肚菌樣品揮發(fā)性物質(zhì)的比較

通過GC-MS分析，共鑒定出81 種揮發(fā)性物質(zhì)，包含8 類揮發(fā)性物質(zhì)：醛類、酮類、酯類、酸類、醇類、雜環(huán)類、烴類及其他。由表1可知，醇類、醛類及酮類是20 個羊肚菌樣品揮發(fā)性物質(zhì)中最主要的3 類，占總含量的60%～80%。

經(jīng)過峰的比較篩選，共得到20 個樣品的24 個共同峰（表2），這些物質(zhì)包括：2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、乙醇、2,3-丁二酮、戊醛、2-甲基戊醛、甲苯、十一烷、己醛、2-甲基丙醇、二甲苯、3-甲基丁醇、桉油精、2-戊基呋喃、正戊醇、正己醇、薄荷酮、薄荷酮異構(gòu)體、苯甲醛、莰酮、乙酸薄荷酯、胡薄荷酮、萘。這些物質(zhì)占總峰面積相對含量平均為77.26%，包含了揮發(fā)物圖譜中主要的信息。從表2可知，20 個羊肚菌樣品中，醛類物質(zhì)中2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛，酮類物質(zhì)中薄荷酮及其異構(gòu)體，醇類物質(zhì)中3-甲基丁醇相對含量較高，且共有物質(zhì)中不同樣品間各類物質(zhì)差異較大，醛類物質(zhì)相對含量為14%～72.42%，醇類物質(zhì)相對含量為4.7%～23.41%，酮類物質(zhì)相對含量為4.4%～30.87%，酯類物質(zhì)相對含量為0.28%～2.55%，烴類物質(zhì)相對含量為2.62%～13.42%，雜環(huán)類物質(zhì)相對含量為2.86%～15.17%，不含酸類物質(zhì)。在所有共有物質(zhì)中，醛類物質(zhì)相對含量最高，平均達(dá)32.19%，其次為酮類物質(zhì)，平均達(dá)到17.33%，再次為醇類物質(zhì)，平均含量達(dá)到11.55%，烴類和雜環(huán)類物質(zhì)相對含量相對較低，分別為6.84%和7.94%，酯類物質(zhì)相對含量最低，為1.40%。從整體上看，不同樣品的揮發(fā)性物質(zhì)變化差異較大，含量變化無明顯規(guī)律性，而以揮發(fā)性物質(zhì)相對含量的變化為依據(jù)對其進(jìn)行品種篩選和分類不科學(xué)，因此，采用PCA和CA的方式對羊肚菌樣品進(jìn)行綜合評價和品質(zhì)區(qū)分，便于選擇品質(zhì)類似羊肚菌樣品，為羊肚菌品種選育和后期生產(chǎn)加工應(yīng)用提供參考條件。

表1 不同種類揮發(fā)性成分在羊肚菌中的相對含量Table 1 Percentage contents of different classes of volatile compounds in M. importuna%

表2 共有物質(zhì)種類及相對含量Table 2 Relative amounts of volatile substances simultaneously detected in 20 samples of M. importuna%

續(xù)表2 %

2.2 羊肚菌揮發(fā)性物質(zhì)的PCA

表3 PCA特征向量、特征值、方差貢獻(xiàn)率及累計方差貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvectors, eigenvalues, variance contribution rates and cumulative contribution rates of the principal components

通過SPSS 22.0軟件對20 個羊肚菌樣品共有揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量進(jìn)行PCA，結(jié)果顯示前6 個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率為90.081%（表3），表明前6 個主成分基本包含了羊肚菌揮發(fā)性物質(zhì)的絕大部分信息，可用于綜合品質(zhì)進(jìn)行評價。前6 個主成分中，第1主成分的貢獻(xiàn)率為33.983%，貢獻(xiàn)最大為薄荷酮及其異構(gòu)體，對應(yīng)的特征值為0.330和0.331，胡薄荷酮、乙酸薄荷酯、莰酮、桉油精、2-甲基丁醛對第1主成分影響也較大。第2主成分的貢獻(xiàn)率為18.567%，貢獻(xiàn)最大為正戊醇，對應(yīng)的特征值為0.393，代表變量有正己醇、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、2-甲基丙醛。第3主成分的貢獻(xiàn)率為14.136%，貢獻(xiàn)最大為十一烷，對應(yīng)的特征值為0.389，代表變量有3-甲基丁醇、戊基呋喃、苯甲醛、莰酮、萘。第4主成分貢獻(xiàn)率為11.697%，貢獻(xiàn)最大為二甲苯，對應(yīng)的特征值為0.408， 2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、萘對其影響較大。第5主成分貢獻(xiàn)率為6.299%，貢獻(xiàn)最大為乙醇，對應(yīng)的特征值為0.664。第6主成分貢獻(xiàn)率5.398%，貢獻(xiàn)最大為甲苯，對應(yīng)的特征值為0.585，丁二酮、甲基戊醛、十一烷、桉油精對其影響較大。

以不同特征值的方差貢獻(xiàn)率βi（i=1,2,3,……,K）為加權(quán)系數(shù)，利用綜合評價函數(shù)F=β1F1+β2F2+β3F3+……+βKFK計算各樣本得分，對羊肚菌樣本的香氣成分進(jìn)行評價。根據(jù)特征值和相應(yīng)的特征向量，用6 個主成分對不同樣品揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行綜合評價，計算樣品的主成分得分，最終基于PCA得到香氣評價模型：

F=33.983%F1+18.567%F2+14.136%F3+11.697%F4+6.299%F5+5.398%F6

總因子F得分越高，表明品質(zhì)越好。由表4可知，樣品4、20、8、14、12分別居主成分得分的前5 名，表明這5 個樣品綜合品質(zhì)表現(xiàn)最好，隨后從高到低排序依次為11、2、10、6、5、13、1、7、3、19、18、15、9、17、16。

表4 不同羊肚菌樣品香氣質(zhì)量評價Table 4 Aroma quality evaluation of different samples

2.3 羊肚菌揮發(fā)性物質(zhì)的CA

采用系統(tǒng)聚類方法，度量標(biāo)準(zhǔn)為平方Euclidean距離，通過組間連接的方式，以共有揮發(fā)性物質(zhì)作為變量，對20 個樣品的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行CA，結(jié)果見圖1。由圖1可知，當(dāng)刻度為15～25時，22 個羊肚菌樣品可分為2 個集群，分別是樣品4為1 個集群，該樣品綜合得分為2.872，綜合主成分得分排名第1，品質(zhì)最優(yōu)，其余19 個樣品為1 個集群，綜合得分在-1.550～1.481間，綜合品質(zhì)低于樣品4；當(dāng)刻度為10～14時，可分為3 個集群，后1 集群可再分為2 個集群，樣品9、17、3、7、19、15、16、1、6、11、18為1 個集群，樣品8、14、10、13、2、5、20、12為1 個集群；當(dāng)刻度在5～10時，在以上分類基礎(chǔ)上，還可再細(xì)分，集成5 個集群，樣品9、17、3、7、19、15、16集成1 個集群，樣品1、6、11、18集成1 個集群，樣品8、14、10、13、2、5、20集成1 個集群，樣品12為1 個集群。CA根據(jù)刻度不同可獲得多種分類結(jié)果，而PCA根據(jù)主成分得分僅獲得一種分類結(jié)果，PCA同CA刻度為15～25時結(jié)果相一致，說明通過二者的分析，均可對20 個羊肚菌樣品進(jìn)行分類，通過對菌株進(jìn)行分類和綜合品質(zhì)評價，可判斷同一集群內(nèi)的菌株香味相似，為菌種選育提供理論依據(jù)，從而指導(dǎo)生產(chǎn)。

圖1 20 個羊肚菌樣品CA樹狀圖Fig. 1 Cluster analysis dendrogram of 20 samples

3 討 論

食用菌香味物質(zhì)主要是食用菌在受熱過程中產(chǎn)生的多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)綜合平衡的結(jié)果，成分差異較大，也比較復(fù)雜，主要有不飽和醛酮、醇類、含硫化合物以及一些萜烯類雜環(huán)化合物等[29-31]，但每種食用菌均有其獨(dú)特的揮發(fā)性物質(zhì)。羊肚菌的香氣來源于豐富多樣的揮發(fā)性物質(zhì)，是羊肚菌具有獨(dú)特香味的重要原因，也是衡量品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。目前羊肚菌在馴化過程中常以感官和產(chǎn)量作為品種篩選標(biāo)準(zhǔn)，以外觀作為品質(zhì)指標(biāo)，以此指標(biāo)進(jìn)行商品分級，而忽略了羊肚菌揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對品質(zhì)的重要影響，導(dǎo)致內(nèi)在品質(zhì)參差不齊。在羊肚菌馴化栽培過程中應(yīng)“量”和“質(zhì)”兼顧，在考慮產(chǎn)量的同時，揮發(fā)性物質(zhì)也是重要的考察因素，是反映羊肚菌品質(zhì)的重要指標(biāo)來源。本實驗通過揮發(fā)性物質(zhì)定性定量檢測，通過PCA進(jìn)行綜合評價，建立香氣評價模型，進(jìn)一步通過CA進(jìn)行區(qū)分和驗證。這種綜合指標(biāo)評價方法可以有效指導(dǎo)羊肚菌生產(chǎn)，提高羊肚菌的商品價值，避免了食用菌研究中常出現(xiàn)的重產(chǎn)量輕品質(zhì)的現(xiàn)象，是未來食用菌品種選育、栽培工藝研究以及產(chǎn)品加工的重要發(fā)展方向。

大量研究表明，揮發(fā)性八碳化合物（C8H16O）是食用菌最重要的風(fēng)味化合物，主要包括1-辛烯-3-醇、1-辛烯-4-醇、3-辛烯-2-醇等，這些物質(zhì)具有濃烈的蘑菇風(fēng)味，尤其是1-辛烯-3-醇，普遍存在于大部分食用菌中[31-34]，但在本研究的20 個羊肚菌樣品中均未檢出，這與1-辛烯-3-醇穩(wěn)定性低，各種干制方法，包括自然干燥、冷凍干燥、滾筒干燥、噴霧干燥和流化床干燥等都可能對它造成破壞有關(guān)[35-36]，但也不排除可能是羊肚菌中不含有1-辛烯-3-醇，它的獨(dú)特香氣與該物質(zhì)無關(guān)，在后續(xù)研究有必要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，驗證該結(jié)果。

4 結(jié) 論

本研究檢測分析了20 個羊肚菌樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量，并采用統(tǒng)計學(xué)方法探討了羊肚菌特征香味物質(zhì)，根據(jù)此研究結(jié)果和香氣模型可為不同品種的羊肚菌樣品提供判定依據(jù)，為羊肚菌在品種選育、品質(zhì)區(qū)分及后期產(chǎn)品加工提供參考。

利用HS-SPME-GC-MS對不同來源、不同品種樣品的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，結(jié)果表明醇、醛、酮類是羊肚菌揮發(fā)性物質(zhì)最主要的3 類，占總量的60%～80%。

20 個樣品中包含了24 個共同物質(zhì)：2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、乙醇、2,3-丁二酮、戊醛、2-甲基戊醛、甲苯、十一烷、己醛、2-甲基丙醇、二甲苯、3-甲基丁醇、桉油精、2-戊基呋喃、正戊醇、正己醇、薄荷酮、薄荷酮異構(gòu)體、苯甲醛、莰酮、乙酸薄荷酯、胡薄荷酮、萘，這些成分含量的差別造成了不同羊肚菌樣本香氣的差異性。

基于PCA法構(gòu)建了羊肚菌綜合香氣評價模型：F=33.983%F1+18.567%F2+14.136%F3+11.697%F4+6.299%F5+5.398%F6，得到不同樣品綜合品質(zhì)得分從高到低為4、20、8、14、12、11、2、10、6、5、13、1、7、3、19、18、15、9、17、16。

通過CA，在刻度為15～25時，羊肚菌樣品可以分為2 個集群，樣品4 為1 個集群，其余樣品為1 個集群，結(jié)果與PCA一致，即綜合品質(zhì)排第1的樣品4為1 類，綜合品質(zhì)排2～20的樣品歸為1 類，由此可見CA法和PCA法能較好地反映羊肚菌樣品間的差異性。