李宏杰 陳志杭 葉斌 葛榮躍 王海明

彎曲菌（Campylobacter spp）是一種重要的人獸共患病的病原體，是引起人胃腸道疾病最主要的病原體之一，使人致病的彎曲菌中99%是空腸彎曲菌，其與沙門菌、志賀菌并列為人類三大腹瀉致病菌，并可帶來其他一些疾病。空腸彎曲菌為苛養(yǎng)菌，常規(guī)的生化檢測較為困難，臨床多以經(jīng)驗(yàn)性治療為主，楊峰等［1］研究提示臨床上在治療急性腹瀉時(shí)存在一定的用藥不符和抗菌藥物使用不正確的情況。作者應(yīng)用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測200例食源性相關(guān)腹瀉患者糞便標(biāo)本中的彎曲菌，以了解與增菌培養(yǎng)分離法檢測結(jié)果的關(guān)系，為臨床診療與公衛(wèi)服務(wù)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 對2015年1月至2017年12月本系統(tǒng)12家社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心就診的食源性相關(guān)腹瀉患者糞便（或肛拭子）標(biāo)本采用直接分離與增菌分離相結(jié)合的方法常規(guī)培養(yǎng)分離獲得200株致瀉菌，其中空腸彎曲菌4株、結(jié)腸彎曲菌1株。

1.2 儀器與耗材 VITEK-2 compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)（法國bioMérieux公司）及其苛養(yǎng)菌（NH）配套鑒定卡，基因擴(kuò)增儀，熒光定量分析儀。

1.3 主要培養(yǎng)基和試劑 Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基（杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品），改良木炭-頭孢哌酮-去氧膽酸鹽瓊脂（CCDA）培養(yǎng)基，改良Campy-BAP彎曲菌培養(yǎng)基及藥敏紙片（均為英國Oxoid公司產(chǎn)品），微需氧袋（法國bioMérieux公司產(chǎn)品）。2Taq PCR Master Mix與PCR Marker購自上海生工生物技術(shù)有限公司；彎曲菌核酸測定試劑盒（單重、二重與多重?zé)晒釶CR法）購自上海之江生物科技股份有限公司。

1.4 儀器校準(zhǔn)及室內(nèi)質(zhì)控 儀器按廠家要求進(jìn)行校準(zhǔn)并按室內(nèi)質(zhì)控的要求完成室內(nèi)質(zhì)控。室內(nèi)質(zhì)控菌株在直接分離、增菌分離、血清學(xué)凝集試驗(yàn)和生化鑒定上與待檢標(biāo)本同步，空腸彎曲菌（ATCC33291）由浙江省臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.5 檢測方法 （1）標(biāo)本采集：采集食源性相關(guān)腹瀉患者糞便（或肛拭子）標(biāo)本，用2支滅菌棉拭子沾取患者糞便后，分別插入2管Carry-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中，盡快送實(shí)驗(yàn)室檢測，樣品采集遵循統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。（2）多重PCR檢測糞彎曲菌：多重PCR方法參照何蕊等的方法引物設(shè)計(jì)［2］，單重、二重和多重PCR用相應(yīng)試劑盒或自行引物組合設(shè)計(jì)進(jìn)行熒光PCR檢測。（3）菌株分離鑒定：①菌株分離培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)室收到待檢糞便標(biāo)本后立即接種于改良CCDA培養(yǎng)基（并用于PCR 檢測），置微需氧袋（5%O2、10%CO2、85%N2）42℃48h，挑取可疑菌落再接種到改良CCDA培養(yǎng)基或哥倫比亞血瓊脂進(jìn)行純培養(yǎng)，繼續(xù)42℃微需氧培養(yǎng)24～48h；另1份待檢糞便標(biāo)本置微需氧袋42℃增菌培養(yǎng)24～48h后接種于改良CCDA培養(yǎng)基（并用于PCR檢測），同直接分離培養(yǎng)法獲取純培養(yǎng)。②菌株常規(guī)生化鑒定：將疑似彎曲菌的純培養(yǎng)物在VITEK-2 compact上使用配套苛養(yǎng)菌（NH）鑒定卡進(jìn)行菌種鑒定。③菌株P(guān)CR鑒定：根據(jù)常規(guī)生化鑒定結(jié)果，再次以PCR（單重、二重與多重?zé)晒釶CR法）檢測復(fù)核（也包括培養(yǎng)陰性的樣本盲刮平板用PCR再次檢測），單重PCR檢測16S rRNA，二重PCR檢測16S rRNA與map A基因，多重PCR檢測16S rRNA、map A與ceu E基因。

1.6 菌株藥敏試驗(yàn) 采用CLSI推薦使用的瓊脂紙片擴(kuò)散法即Kirby-Bauer（K-B）法。將被檢菌制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海鶆蛲磕ㄔ诤穸葹?mm的Campy-BAP培養(yǎng)基上，42℃平衡10～15min，貼抗菌藥敏紙片，置微需氧袋42℃孵育48h后按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)（結(jié)合確切概率法）分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 增菌前后彎曲菌檢出率 糞便標(biāo)本直接培養(yǎng)分離法的檢出率為1.50%（3/200），PCR法（多重PCR、單重PCR或二重PCR）直接檢測糞便標(biāo)本彎曲菌的檢出率均為2.50%（5/200）。由于陽性病例偏少，增菌培養(yǎng)前，二類方法的檢出率無明顯差異（χ2=0.5102，P＞0.05）。增菌后，培養(yǎng)分離法的檢出率為2.00%（4/200），PCR法的檢出率為2.00%（4/200），二類方法的檢出率無明顯差異（χ2=0.0000，P＞0.05）（見表 1），有1例未能分離出菌落但平板盲刮PCR法仍可檢出。

表1 200份糞便標(biāo)本增菌培養(yǎng)前后彎曲菌的檢出率

2.2 菌種鑒定結(jié)果 多重PCR的檢出空腸彎曲菌4例，結(jié)腸彎曲菌1例（在二重PCR檢測僅有16S rRNA熒光曲線，在多重PCR檢測有16S rRNA和ceu E兩條熒光曲線）；增菌培養(yǎng)分離法菌種生化鑒定菌種結(jié)果與多重PCR一致。

2.3 菌株藥敏結(jié)果 所有菌株對碳青霉烯類、氨基糖苷類和-內(nèi)酰胺類/酶抑制劑復(fù)合制劑多敏感，對其他抗菌素可耐藥。

3 討論

在發(fā)展中國家，彎曲菌是嬰幼兒感染性腹瀉最常見的病原菌［3］。盡管彎曲菌的流行已引起各界廣泛關(guān)注，但由于其暴發(fā)少，病死率低，加上培養(yǎng)條件苛刻，許多監(jiān)測機(jī)構(gòu)（尤其是基層結(jié)構(gòu)）尚未建立起對彎曲菌的監(jiān)測系統(tǒng)，缺乏有力的控制手段。因此探索適宜的空腸彎曲菌檢測方法顯得尤為重要。

由于陽性病例偏少，可能導(dǎo)致增菌培養(yǎng)前，二類方法的檢出率無明顯差異（χ2=0.5102，P＞0.05），但PCR直接檢測的陽性率還是有高于直接培養(yǎng)分離法的趨勢。RantsiouK等［4］報(bào)道，在增菌前定量PCR的檢測靈敏度明顯高于培養(yǎng)分離法，定量PCR的檢測率高達(dá)87%（42/48），而培養(yǎng)分離法的檢測率31.25%（15/48）。這可能與標(biāo)本中的目標(biāo)菌含量太低（低于培養(yǎng)分離法的檢測限）、“活的非可培養(yǎng)（viable but noncultureable，VBNC）”狀態(tài)、營養(yǎng)與培養(yǎng)條件以及抗生素的使用等因素有關(guān)。同時(shí)，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的不穩(wěn)定改變也可能導(dǎo)致菌種生化鑒定失真。增菌可能有利于提高標(biāo)本中低劑量成活目標(biāo)菌的培養(yǎng)分離法的檢出率。Lund等［5］實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)有11份雞糞便標(biāo)本直接接種CCDA平板鑒定結(jié)果為陰性，而增菌后再接種CCDA平板時(shí)鑒定結(jié)果則為陽性。而本資料使用的改良CCDA平板在糞便標(biāo)本直接接種與增菌后培養(yǎng)分離法的檢測率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.1454，P＞0.05），可能觀察例數(shù)太少，但也說明提高彎曲菌選擇性培養(yǎng)基性能的重要性，建議酌情使用改良CCDA平板或改良的Skirrow血瓊脂平板等，并可直接接種。與此相反，增菌后可能導(dǎo)致PCR法的檢出率有所降低，可能是由于增菌液顯著稀釋了部分標(biāo)本中目標(biāo)菌或目標(biāo)菌的DNA相對濃度而導(dǎo)致檢出率下降。

目前公認(rèn)，PCR法檢測彎曲菌的敏感度明顯高于培養(yǎng)分離法，特異性強(qiáng)，簡便快速。其中，多重PCR技術(shù)特異性更強(qiáng)，也可具有鑒別診斷的作用；培養(yǎng)分離法雖然操作繁瑣，但仍是獲取菌株鑒定、藥敏的基本途徑。因此，應(yīng)根據(jù)檢測目的、自身?xiàng)l件等因素選擇合適的檢測方法和分離程序。多重PCR比較適合于食源性相關(guān)腹瀉患者糞彎曲菌的快速檢測，也應(yīng)重視培養(yǎng)分離法對鑒定與藥敏的地位，努力優(yōu)化選擇性培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。在VITEK-2 compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)苛養(yǎng)菌（NH）鑒定菌種數(shù)據(jù)庫里，有空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌、胎兒彎曲菌等菌種供系統(tǒng)判定，能夠滿足臨床需要。PCR法是目前對彎曲菌分離菌株進(jìn)行鑒定的通用參比方法［6］，實(shí)際工作中可以根據(jù)需要使用單一的或不同的基因組合來檢測，以判定彎曲菌屬種［7-8］，盡可能保留16S rRNA基因檢測在彎曲菌分子診斷與菌屬種鑒定中的基礎(chǔ)作用。而已經(jīng)發(fā)展起來的環(huán)介導(dǎo)恒（等）溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)［9］有望得到一致的認(rèn)可與評價(jià)，工作中應(yīng)做好LAMP檢測多項(xiàng)單一指標(biāo)的復(fù)合評判，為臨床診療提供及時(shí)的有用的信息。