肖毓，張洪攀，譚榜憲

637000 四川 南充，川北醫(yī)學院 臨床醫(yī)學系(肖毓、張洪攀)，醫(yī)學影像學院(譚榜憲)；637000 四川 南充，川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院 腫瘤科(譚榜憲)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是世界上最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)GLOBOCAN 2018數(shù)據(jù)，2018年胃癌新發(fā)病例超過1 000 000例，占全球腫瘤發(fā)病率的第5位，其中死亡病例達到783 000例，占全球惡性腫瘤導致死亡的第3位[1]。早期胃癌檢出率低，約40%的胃癌患者在確診時已為晚期[2]。目前，化療是晚期胃癌患者的首選治療方法，但化療藥物不良反應重，耐藥率高。作用于特定靶點的靶向藥物因其藥物不良反應較輕、耐藥率低、患者服藥方便等優(yōu)點成為治療晚期胃癌的新治療手段之一[3]。因此從分子水平研究胃癌發(fā)生發(fā)展的機制有利于發(fā)現(xiàn)關鍵靶點，開發(fā)新的靶向藥物，有利于延長患者生存時間、改善患者生活質(zhì)量。

纖維膠原家族中有多種成員，其中Ⅰ型膠原α2鏈(collagen type1 alpha2，COL1A2)基因編碼的I型膠原是最廣泛表達于人體的膠原,它起到支撐基質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用,形成大多數(shù)實體腫瘤的間質(zhì)部分。研究發(fā)現(xiàn)，COL1A2基因主要通過細胞外基質(zhì)受體互作通路和局部黏附通路，影響細胞的增殖、分化、黏附和轉(zhuǎn)移，主要與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關[4- 5]。多項研究顯示COL1A2的表達可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關，但由于研究方法、樣本量及人群的差異，其結(jié)論可靠性較低，且其表達水平與患者預后之間的關系目前尚不清楚。因此我們在Oncomine數(shù)據(jù)庫中深度挖掘胃癌的基因芯片中與COL1A2表達有關的數(shù)據(jù)，二次薈萃分析COL1A2在胃癌中的表達及預后。

1 材料與方法

1.1 基于Oncomine數(shù)據(jù)庫篩選目標基因

篩選條件為：①“Analysis Type:Cancer VS Normal Analysis”;②“Cancer type:Gastric cancer”；③“Data Type:mRNA”；④設定條件：over- expression。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.2 數(shù)據(jù)提取

設置的數(shù)據(jù)提取條件為：①“Gene：COL1A2”；②“Analysis Type：Cancer VS Normal Analysis”；③“Cancer Type:Gastric cancer”;④“Data Type：mRNA”；⑤臨界值設定條件(Pvalue<0.05，fold change>2，gene rank=top 10%)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.3 Kaplan Meier-Plotter(http://kmplot.com/analysis/)在線生存分析

本研究中篩選條件為：①“Cancer：Gastric Cancer”；②“Gene：COL1A2”；③“Split patients by: Auto select best cutoff ”; ④“Survival：OS”; ⑤亞組分析根據(jù)Laurane Classification，分別為：“instestinal、diffuse、mixed”。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 基于TCGA數(shù)據(jù)對COL1A2在胃癌中的表達及預后進行驗證

UALCAN(ualcan.path.uab.edu/analysis.html)是一個基于TCGA數(shù)據(jù)集，腫瘤基因表達與生存分析的在線數(shù)據(jù)庫[6]。在UALCAN數(shù)據(jù)庫中驗證COL1A2在胃癌中的表達及預后。篩選條件：①“gene：COLIA2”；②“cancer type: stomach adenocarcinoma”；③“Split patients by: Auto select best cutoff”。P<0.05為差異有有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 篩選出目標基因COL1A2

目標基因的選擇：根據(jù)我們設置的篩選條件從Oncomine數(shù)據(jù)庫中得到相關眾多基因中，按照中位秩次從前向后選擇，排除已有相關詳細報道的基因，最終選擇COL1A2基因，COL1A2基因在所有差異表達基因里中位秩次為76.0，P<0.001(圖1)。

2.2 COL1A2在常見腫瘤類型中的表達結(jié)果

圖2顯示Oncomine數(shù)據(jù)庫中共納入了348項關于COL1A2在不同腫瘤組織及對應正常組織中表達水平的研究結(jié)果，其中關于COL1A2表達有統(tǒng)計學意義的研究結(jié)果有102項，91項研究結(jié)果顯示COL1A2在腫瘤組織中高表達。

2.3 COL1A2在胃癌中的表達結(jié)果

在Oncomine數(shù)據(jù)庫中有9項研究顯示COL1A2在胃癌組織和正常組織中的表達差異有統(tǒng)計學意義，有478個樣本，包括腸型、彌漫型、混合型胃癌組織與正常組織的比較。文章分別發(fā)表于“Med Oncol”“Mol Biol Cell”“Clin Cancer”“Nucleic Acids”“Eur J Cancer”中。薈萃9個研究分析發(fā)現(xiàn)，與胃正常組織相比，COL1A2在胃癌組織中高表達，P<0.001(圖3)。

圖1 在Oncomine數(shù)據(jù)庫中篩選出基因COL1A2，中位秩次76.0

Figure1.COL1A2Screened from Oncomine (Median Rank76.0)

*Inthefigure,grayindicatesdatanotdetected;whiteisequivalenttonormaltissue;redthatup.

圖 2COL1A2基因在 Oncomine 數(shù)據(jù)庫中所有腫瘤研究中的表達情況

Figure2.Expression ofCOL1A2in All Cancer Studies from Oncomine

圖3 9項研究顯示COL1A2在胃癌組織與正常胃組織中的表達差異

Figure3.Nine Studies Showing the Expression ofCOL1A2in Gastric Cancer Tissue and Normal Gastric Tissue

2.4 COL1A2在各胃癌基因芯片中的差異

圖4所示為Oncomine數(shù)據(jù)庫中COL1A2在不同胃癌基因芯片中的表達結(jié)果。在Wang等[7]、Chen等[8]、Cho等[9]、Cui等[10]、D′Errico等[11]5項研究中，COL1A2在胃癌中的表達量均高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.001)。

圖4COL1A2基因在Oncomine數(shù)據(jù)庫中各項胃癌研究中的差異表達

Figure4.Differential Expression ofCOL1A2in Various Gastric Cancer Studies from Oncomine

a.WangGastric(cancervsnormal，P=2.81E-7);b.ChenGastric(intestinaltypecancervsnormal,P=6.07E-25);c.ChenGastric(diffusetypecancervsnormal,P=2.23E-10);d.ChenGastric(mixedtypecancervsnormal,P=4.51E-5);e.ChoGastric(diffusetypecancervsnormal,P=1.89E-12);f.ChoGastric(intestinaltypecancervsnormal，P=9.69E-6);g.CuiGastric(cancervsnormal,P=9.49E-12);h.D′ErricoGastric(intestinaltypecancervsnormal,P=5.42E-14);i.D′ErricoGastric(mixedtypecancervsnormal,P=2.37E-8).

2.5 COL1A2基因在胃癌中表達水平與預后關系

為了明確COL1A2表達與胃癌預后之間的關系，我們利用The Kaplan Meier- Plotter (http://kmplot.com/analysis/)在線數(shù)據(jù)庫進行生存分析。結(jié)果顯示[12]：COL1A2表達水平與胃癌患者總體生存時間存在相關性。與低表達組相比，COL1A2高表達組胃癌患者總生存時間縮短(P<0.001)。進一步亞組分析發(fā)現(xiàn)，COL1A2表達水平對腸型和彌漫型胃癌患者OS有影響(P值分別為P<0.001和P=0.001)，而在混合型胃癌患者中，其表達水平對OS無影響(P>0.05)(圖5)。

圖5 Kaplan Meier-Plotter數(shù)據(jù)庫對COL1A2基因在胃癌患者中的表達水平進行在線生存分析

Figure5.Online Survival Analysis of the Expression Level ofCOL1A2in Gastric Cancer Patients by Using Kaplan Meier-Plotter

a.EffectofCOL1A2expressioningastriccancerpatientsonoverallsurvival;b.EffectofCOL1A2expressionindiffusegastriccancerpatientsonoverallsurvival;c.EffectofCOL1A2expressioninintestinalgastriccancerpatientsonoverallsurvival;d.EffectofCOL1A2expressioninmixedgastriccancerpatientsonoverallsurvival.

2.6 基于TCGA數(shù)據(jù)對COL1A2在胃癌中的表達及預后進行驗證

UALCAN(ualcan.path.uab.edu/analysis.html)數(shù)據(jù)庫在線分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，COL1A2在胃癌組織中高表達(圖6)，與表達較低的患者相比，高表達COL1A2的胃癌患者總生存期縮短(P<0.05)。(圖7)

圖6COL1A2在TCGA數(shù)據(jù)集胃癌患者中的表達情況

Figure6.Expression ofCOL1A2in Gastric Cancer Patients from TCGA

圖7 TCGA數(shù)據(jù)集中COL1A2表達水平與胃癌患者生存時間的相關性分析

Figure7.Analysis of Correlation betweenCOL1A2Expression Level and Gastric Cancer Patient Survival from TCGA

3 討 論

胃癌是中國常見的惡性腫瘤之一，幽門螺桿菌是胃癌的主要危險因素，近90%的非賁門胃癌的發(fā)病歸因于這種細菌[13- 14]。腌制食品的攝入、飲酒、吸煙也會增加胃癌的發(fā)病風險[14- 15]。隨著手術(shù)技術(shù)的改進和傳統(tǒng)放療、化療和新輔助治療的實施，早期胃癌的5年生存率大大提高。近年來，隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，逐漸面市的靶向藥物不僅用于晚期胃癌姑息治療，而且在局部進展期胃癌圍手術(shù)期治療中也發(fā)揮著重要作用。因此尋找胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵靶點，對于研發(fā)治療胃癌的靶向藥物具有重要的意義。

在哺乳動物細胞中，Ⅰ型膠原蛋白含量豐富，它是由2 條COL1A1基因編碼的α1鏈和1條COL1A2基因編碼的α2鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋之間通過氫鍵緊密地結(jié)合在一起[16]。I 型膠原纖維參與形成細胞外基質(zhì)，對于細胞的粘附及分化有重要作用，和正常細胞相比，腫瘤細胞間的粘附作用普遍降低，促進了腫瘤細胞的遷移[17]。研究表明COL1A2基因參與頭頸部癌[18]、食管癌[19]、肝癌[20]、結(jié)腸癌[21- 22]、膀胱癌[23]、腎癌[24]、惡性黑色素瘤[25]等多種惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移等過程中。COL1A2基因參與編碼Ⅰ型膠原，該基因的差異表達在人類惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中產(chǎn)生明顯的膠原介導的作用，影響腫瘤細胞增殖及遠處轉(zhuǎn)移[26]，但其在各種腫瘤中具體的作用機制目前仍尚未明確。

Misawa等[18]、Brooks等[23]分別發(fā)現(xiàn)COL1A2在頭頸部鱗癌、膀胱癌中下調(diào)的機制是啟動子區(qū)域的CpG高甲基化作用。CpG高甲基化的COL1A2基因失活可能有助于頭頸部鱗癌、膀胱癌細胞的增殖和遷移。Fang等[19]發(fā)現(xiàn)COL1A2基因的高表達與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，COL1A2mRNA的表達水平可用作監(jiān)測食管鱗癌早期發(fā)生及干預治療效果的有用指標。Zhu等[20]發(fā)現(xiàn)由內(nèi)源性非編碼miRNAlet- 7g介導的COL1A2基因位點的多態(tài)性可使肝細胞肝癌風險增加1.73倍，COL1A2與肝細胞肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。Yu等[21]發(fā)現(xiàn)COL1A2基因表達水平在結(jié)直腸癌中明顯下調(diào),其表達量與結(jié)直腸癌的分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(P<0.05)。在結(jié)直腸癌SW480和SW620細胞系中過表達COL1A2可以減弱腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲的能力。并且該研究發(fā)現(xiàn)COL1A2基因可能是通過參與NF- κB途徑調(diào)控結(jié)直腸癌細胞的功能。Li等[27]通過定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中COL1A2mRNA表達量顯著高于癌前和正常胃組織，并且發(fā)現(xiàn)COL1A2表達水平與腫瘤大小及侵襲深度呈正相關。Ao等[28]研究發(fā)現(xiàn)COL1A2基因沉默抑制胃癌細胞增殖，遷移和侵襲，同時通過PI3K-Akt信號通路促進腫瘤細胞凋亡。Rong等[29]對75例人胃癌組織進行檢測發(fā)現(xiàn)，與正常胃組織相比，COL1A2在人胃癌中高度表達。統(tǒng)計分析顯示COL1A2表達水平與組織學類型和淋巴結(jié)狀態(tài)顯著相關。

盡管目前有研究發(fā)現(xiàn)COL1A2在胃癌患者中高表達，但由于各獨立研究存在樣本量大小及研究方法不一致等原因，其結(jié)論的真實性和可靠性有待考究。而對于COL1A2表達水平對胃癌患者預后的影響，目前為止一直缺乏強有力的證據(jù)。因此，基于目前研究背景，我們薈萃分析了Oncomine數(shù)據(jù)庫中胃癌組織的基因芯片。Oncomine 數(shù)據(jù)庫涵蓋了TCGA數(shù)據(jù)、GEO數(shù)據(jù)和目前已發(fā)表文獻的RNA和DNA-seq數(shù)據(jù)，截至目前，該數(shù)據(jù)庫共收集了715個基因表達數(shù)據(jù)集，86 733個正常組織和癌癥組織的數(shù)據(jù),旨在挖掘新的生物標記物或新的治療靶點[30]。在此數(shù)據(jù)庫中可根據(jù)自己的需求設定篩選和挖掘數(shù)據(jù)的條件。我們通過Oncomine數(shù)據(jù)庫挖掘COL1A2基因在眾多常見腫瘤中的表達信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，102項研究有統(tǒng)計學意義，91項研究發(fā)現(xiàn)COL1A2在常見腫瘤中高表達。利用Oncomine數(shù)據(jù)庫進一步薈萃分析證實，與胃正常組織相比，COL1A2在胃癌組織中高表達，差異有統(tǒng)計學意義。The Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)是目前可信度較強的預后相關分析的在線分析數(shù)據(jù)庫，包含了1 065例胃癌樣本，可對54 675個基因進行相關預后分析。本文通過 The Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)了COL1A2在胃癌患者中的預后價值，結(jié)果顯示，COL1A2的表達水平與胃癌患者的總體生存時間相關，COL1A2高表達胃癌患者的總生存時間降低。亞組分析發(fā)現(xiàn)，COL1A2表達水平與腸型、彌漫型胃癌患者OS呈負相關，而在混合型胃癌患者中，其表達水平對OS無影響。我們進一步通過基于TCGA數(shù)據(jù)集的UALCAN數(shù)據(jù)庫驗證了這一結(jié)論。本研究中，我們利用基因芯片數(shù)據(jù)庫薈萃分析了各獨立研究，樣本量大，結(jié)論的可信度較強。

4 結(jié) 論

本研究基于Oncomine數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上，與正常胃組織相比，COL1A2基因在胃癌組織中高表達，進行在線生存分析發(fā)現(xiàn)，與COL1A2基因低表達組相比，COL1A2基因高表達的胃癌患者總體生存期降低，進一步亞組分析發(fā)現(xiàn)，COL1A2基因高表達的腸型、彌漫型胃癌患者總體生存期降低。本研究結(jié)果為胃癌的COL1A2分子機制的研究和靶向藥物治療提供了理論支持。

作者聲明：本文第一作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔相應責任；

利益沖突：本文全部作者均認同文章無相關利益沖突；

學術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學術(shù)不端文獻檢測系統(tǒng)學術(shù)不端檢測；

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