王艷琳，滿成連，馮 政，陳素娟，秦 濤，彭大新

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省家禽疫病防控工程技術(shù)研究中心，江蘇揚(yáng)州225000)

雞白痢沙門菌(Salmonella enterica serovar Pullorum)可以通過水平傳播和垂直傳播而引起雛雞的雞白痢，造成較高的發(fā)病率和死亡率[1-3]。該病在我國雞群中分布較廣，其也是《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)》確定的優(yōu)先防治病種。由于抗生素的使用會導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性增加，疫苗免疫成為凈化該病的重要手段。減毒疫苗較滅活疫苗而言，不僅能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，而且還能產(chǎn)生細(xì)胞免疫和黏膜免疫應(yīng)答。因此，研制雞白痢沙門菌減毒疫苗成為近年來國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。生物被膜(Biofilm)是細(xì)菌在生長過程中附著在物體表面形成的膜樣復(fù)合物[4]，可以增強(qiáng)細(xì)菌對外界環(huán)境的耐受力。卷曲菌毛是生物被膜的主要成分之一，其結(jié)構(gòu)亞基csgA由操縱子csgBAC合成，缺失后會影響生物被膜形成[5]。ompR基因是EnvZ/OmpR雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，缺失該基因后的細(xì)菌不能分泌外膜蛋白OmpF，影響菌體對環(huán)境的適應(yīng)力[6]，其也可以與CsgD啟動子結(jié)合間接影響細(xì)菌生物被膜的形成。

本實(shí)驗(yàn)室前期基于λ-Red同源重組系統(tǒng)在S6702△rfaG和S6702△rfaL單基因缺失株基礎(chǔ)上構(gòu)建了一系列雞白痢沙門菌雙基因缺失株S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA和三基因缺失株、S6702△rfaG△csgA△ompR、 S6702△rfaL△csgA△ompR，免疫效力試驗(yàn)結(jié)果顯示這些缺失株均具有較好的免疫保護(hù)作用和體內(nèi)安全性[7]。但由于活菌會隨動物體向環(huán)境外排放，對生物安全造成潛在的風(fēng)險，因此開展減毒候選疫苗株的生物安全評價不可或缺。因此本研究對上述缺失株開展了生物被膜形成能力測定、酸堿、溫度、紫外線環(huán)境應(yīng)激試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)及兩種消毒劑滅活效果試驗(yàn)，判定各菌株在不同環(huán)境中的生存能力，為疫苗侯選株的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌 株 雞白痢沙門菌野生菌株S6702由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存，雞白痢沙門菌基因缺失株S6702△rfaG、S6702△rfaL、S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA、S6702△rfaG△csgA△ompR、S6702△rfaL△csgA△ompR由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。腸炎沙門氏菌活疫苗Sm24由羅曼公司生產(chǎn)。

1.2 主要試劑 DL2000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；結(jié)晶紫(Crystal Violet)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基TSB購自Fluka公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、氯化鈉、純化瓊脂粉等均購自國藥集團(tuán)；衛(wèi)可過硫酸氫鉀復(fù)合物粉由英國安德國際有限公司生產(chǎn)；中牧金碘聚維酮碘溶液由中牧南京動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.3 生長曲線的測定 將野生沙門菌S6702、單基因缺失株S6702△rfaG、S6702△rfaL、雙基因缺失株S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA以及三基因缺失株 S6702△rfaG△csgA△ompR和 S6702△rfaL△csgA△ompR于37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔1.5 h檢測一次培養(yǎng)物的OD600nm值，連續(xù)測定8次，共計12 h，重復(fù)3次試驗(yàn)，最后將所得數(shù)據(jù)利用GraphPad prism軟件繪制細(xì)菌的生長曲線。

1.4 沙門菌生物被膜形成的檢測 參照Pratt等方法[8]，挑取野生沙門菌S6702及6株基因缺失株的單個菌落分別接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min過夜震蕩培養(yǎng)，利用1∶10 TSB培養(yǎng)基以1∶100比例稀釋各菌液后接種于96孔U型細(xì)胞培養(yǎng)板，對照組接種100 μL無菌1∶10 TSB培養(yǎng)基，置28℃靜置培養(yǎng)72 h后，取出培養(yǎng)板，棄菌液，利用結(jié)晶紫溶液每孔100 μL避光染色20 min，在培養(yǎng)板底部形成生物被膜環(huán)，倒出培養(yǎng)板內(nèi)液體，超純水洗滌3遍，利用乙醇丙酮溶液溶解沉積于培養(yǎng)板底部的生物被膜環(huán)，利用酶標(biāo)儀測定各菌的OD550nm值。每次試驗(yàn)重復(fù)2個孔，試驗(yàn)重復(fù)3次取其平均值。

1.5 環(huán)境應(yīng)激試驗(yàn) 將野生菌株S6702、腸炎沙門菌疫苗菌株Sm24與6株基因缺失株在LB平板于37℃靜置培養(yǎng)24 h后挑取若干單菌落全板均勻劃線于LB瓊脂平板上，37℃靜置培養(yǎng)至對數(shù)生長期(約6 h)，用含15%甘油的PBS將LB平板上的細(xì)菌全部刮下，放置于指形管中，12 000 r/min離心10 min，再用15%甘油PBS洗滌2～3次，調(diào)節(jié)菌液OD600nm=0.4，作為后期試驗(yàn)的初始菌液。

參照Han等[9]方法，取 100 μL OD600nm=0.4的各菌株菌液順次加入900 μL pH分別為7.2、6.0、5.0和4.0的LB肉湯和pH為7.2和8.0的Tris-Cl中，置于37℃震搖培養(yǎng)30 min作為實(shí)驗(yàn)組，以各菌株在pH為7.2的LB(中性LB)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)做為對照組，檢測各菌株對酸堿的耐受能力。

選取OD600nm=0.4的各菌株菌液100 μL分別置于900 μL的pH為7.2的LB肉湯培養(yǎng)基中，54℃震搖培養(yǎng)3 min作為實(shí)驗(yàn)組，將相應(yīng)菌株置于37℃震搖培養(yǎng)3 min作為對照組，檢測各菌株對高溫的耐受能力。

選取OD600nm=0.4的菌液1 mL置于9 mL的pH為7.2的LB肉湯培養(yǎng)基中，并均勻散布于無菌培養(yǎng)皿中，置于紫外燈下25 cm處分別照射2 min和5 min作為實(shí)驗(yàn)組，將各相應(yīng)菌株菌液開蓋置于白熾燈25 cm處處理5 min作為對照組，

經(jīng)不同環(huán)境處理后的菌液離心后收集菌體，使用15%甘油PBS洗滌并重懸，10倍倍比稀釋后涂布于麥康凱平板，培養(yǎng)18 h后菌落計數(shù)。每組試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.6 藥敏試驗(yàn) 采用紙片瓊脂擴(kuò)散K-B法[10]檢測雞白痢沙門菌野生菌株S6702、6株基因缺失株和腸炎沙門氏菌活疫苗株Sm24對7種常見藥物的敏感性試驗(yàn)。根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(CLSI/NCCLS)2005年標(biāo)準(zhǔn)，腸桿菌科耐藥抑菌圈直徑判定標(biāo)準(zhǔn)為諾氟沙星、慶大霉素、氯霉素≤12 mm；卡那霉素、萘啶酸≤13 mm；四環(huán)素≤14 mm、環(huán)丙沙星≤15 mm。

1.7 消毒劑滅活效果試驗(yàn) 初始菌液的準(zhǔn)備同1.5，衛(wèi)可過硫酸氫鉀粉劑根據(jù)參考使用說明按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400 配置，商品化聚維酮碘溶液稀釋至濃度為0.1%和0.01%。參照Guo等試驗(yàn)方法[11]，分別取野生菌株S6702、腸炎沙門菌疫苗株Sm24與6株基因缺失株OD600nm為0.4的各菌株菌液各100 μL置于900 μL的上述不同濃度的各消毒劑溶液中，于37℃震蕩培養(yǎng)5 min，立即離心收集菌體，經(jīng)15%甘油PBS洗滌并重懸，10倍倍比稀釋后涂布于麥康凱平板，培養(yǎng)18 h后菌落計數(shù)。每組試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理 各試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Graphpad prism軟件繪制圖像并經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果

2.1 各菌株生長曲線的測定結(jié)果 同時對野生菌株S6702及6株基因缺失株進(jìn)行生長曲線的測定。結(jié)果顯示，與野生菌株S6702相比，所有的基因缺失株的生長速度均未出現(xiàn)顯著變化(p＞0.05)，且基因缺失株的生長曲線具有明顯的對數(shù)生長期(圖1)，表明rfaL、csgA和rfaG基因的缺失不影響細(xì)菌的生長能力，可以滿足疫苗株的研制需要。

2.2 各菌株生物被膜形成能力的測定結(jié)果 在96孔板中以結(jié)晶紫染色定量法測定各菌株的生物被膜形成能力。結(jié)果顯示單基因缺失株S6702△rfaG、S6702△rfaL的OD550nm與野生菌株S6702相比稍有降低，但無顯著差異(p＞0.05)，而雙基因缺失株S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA和三基因缺失株S6702△rfaG△csgA△ompR、S6702△rfaL△csgA△ompR的生物被膜形成能力較野生菌株S6702則顯著降低(p＜0.01)(圖2)。結(jié)果表明，缺失生物被膜相關(guān)基因csgA或/和ompR后雞白痢沙門菌喪失了生物被膜的形成能力。

2.3 各菌株對環(huán)境應(yīng)激的試驗(yàn)結(jié)果 對各菌株進(jìn)行酸耐受試驗(yàn)，結(jié)果顯示當(dāng)LB培養(yǎng)基的pH=6.0時，三基因缺失株S6702△rfaG△csgA△ompR和S6702△rfaL△csgA△ompR的存活率較在pH=7.2的中性LB中的存活率有所降低，其余基因缺失株和野生菌株的存活率與在中性LB培養(yǎng)基中相比有所上升；當(dāng)LB培養(yǎng)基的pH=5.0時，疫苗株Sm24和單基因缺失株S6702△rfaG的存活率與在中性LB培養(yǎng)基中相比無顯著差異(p＞0.05)，其余菌株的存活率均開始下降；當(dāng)LB培養(yǎng)基的pH為4.0時，所有被測菌的存活率均開始顯著下降(p＜0.01)，其中基因缺失株的存活率較野生菌株S6702和疫苗株Sm24的更低(p＜0.001)(圖 3A)。

堿耐受試驗(yàn)中，與pH=7.2的中性LB對照組和pH=7.2的Tris-Cl中相比較，各菌株的存活率在pH為8.0的Tris-Cl中時均呈現(xiàn)指數(shù)下降趨勢。疫苗株Sm24和6株基因缺失株的存活率較野生菌株S6702更低(p＜0.001)(圖3B)。表明，雙基因缺失株和三基因缺失株均對pH=4.0的酸性培養(yǎng)條件和pH=8.0的堿性培養(yǎng)條件較野生菌株更敏感，且呈現(xiàn)出了微耐酸和不耐堿的生物學(xué)特性。

54℃處理3 min后的各菌存活率變化結(jié)果顯示，疫苗株Sm24的存活率為其37℃對照組的48.2%，野生菌株S6702及各基因缺失菌株的存活率為各自對照組的19%～38.2%(圖3C)，各實(shí)驗(yàn)組與37℃對照組各菌株存活率均差異顯著(p＜0.01)，表明各菌株的生長在54℃條件下均能夠被有效抑制。

紫外應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)果顯示各菌株在紫外線照射后存活率較對照組均顯著降低(p＜0.01)。紫外線照射2 min后各菌株存活率為各自對照組的33.7%～69.5%，紫外照射5 min后各菌株存活率為各自對照組的17.9%～35.2%(圖3D)，各菌株存活率隨著紫外線照射時間的延長而下降，表明生產(chǎn)實(shí)踐中利用紫外線照射滅活環(huán)境中殘留活菌的方案是可行的。

2.4 各菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 為評估基因缺失突變對雞沙門氏菌耐藥性的影響，選擇了7種抗生素對該菌野生菌株S6702、6株基因缺失株及腸炎沙門氏菌疫苗株Sm24的耐藥性進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，各菌株對7種抗生素的敏感性均較高，野生菌株S6702與其基因缺失株之間耐藥性相似(表1)，表明各基因缺失并未改變雞白痢沙門菌的耐藥性。

2.5 消毒劑對各菌株滅活效果的檢測結(jié)果 過硫酸氫鉀復(fù)合物粉劑的消毒效果顯示，其對野生菌株S6702的有效滅活濃度為1:50，對單基因缺失株的有效滅活濃度為1∶100，對多基因缺失株的有效滅活濃度為1∶200，對疫苗株Sm24的滅活濃度為1∶400(圖4A)。聚維酮碘溶液的消毒效果顯示，0.1%的稀釋濃度即可滅活測定的所有菌株(圖4B)。表明，兩種不同成分的消毒劑均能夠滅活被測菌株，但缺失生物被膜形成能力的雙基因缺失和三基因缺失株對過硫酸氫鉀的敏感性更高，生物安全性更好。

3 討論

目前我國養(yǎng)禽業(yè)的養(yǎng)殖形式多樣，養(yǎng)殖規(guī)模參差不齊，生物安全體系尚不健全，導(dǎo)致沙門菌的污染較為嚴(yán)重，而雞白痢沙門菌垂直傳播等生物學(xué)特性使得雞白痢的防控更為困難。截至目前，成熟的商品化雞白痢疫苗尚未出現(xiàn)。脂多糖(Lipopolysac-charides，LPS)是合成沙門菌等革蘭氏陰性菌外膜的重要成分，也是細(xì)菌發(fā)揮毒力的重要因子。吳白等通過同源重組方法構(gòu)建的LPS相關(guān)基因缺失株S6702△rfaL和S6702△rfaG不僅毒力降低，免疫原性高，而且具有DIVA(Differentiation of infected and vaccinated animals)特性[12]。本實(shí)驗(yàn)室前期在該基因缺失株基礎(chǔ)上構(gòu)建的csgA和/或ompR基因缺失株均失去生物被膜形成能力，在毒力降低的基礎(chǔ)上對環(huán)境適應(yīng)的能力下降，其具備更好的生物安全性。本實(shí)驗(yàn)通過生長曲線的測定結(jié)果顯示，雙基因缺失株在普通LB培養(yǎng)基中的生長速度與野生菌株相似，三基因缺失株生長速度略慢于野生菌株，但基因缺失株均可以滿足制備疫苗所需的劑量。

表1 野生菌株和缺失株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

環(huán)境應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)果顯示，沙門菌在酸堿耐受試驗(yàn)中表現(xiàn)出了微耐酸和不耐堿的特性，這可能與雞白痢沙門菌的感染途徑相關(guān)。消化道是沙門菌侵入機(jī)體的主要感染途徑，為抵抗胃酸環(huán)境，沙門菌能夠激活自身的酸耐受應(yīng)答反應(yīng)(Acid tolerance response，ATR)[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示培養(yǎng)基的pH為8.0時，各沙門菌活菌數(shù)已呈指數(shù)下降的趨勢。在熱應(yīng)激和紫外耐受試驗(yàn)中，各菌株的增殖能力均能夠被有效抑制。各方面環(huán)境應(yīng)激結(jié)果均顯示，生物被膜合成相關(guān)基因ompR和/或csgA缺失菌株的環(huán)境適應(yīng)力下降，在環(huán)境中更易被滅活，具備更高的生物安全特性。

喹諾酮類藥物曾廣泛應(yīng)用到家禽沙門菌感染的治療，但近年來，由于不合理的使用導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。沈欣悅等對2013年華東地區(qū)分離的禽源沙門菌耐藥分析結(jié)果顯示，高達(dá)90%的分離株均對喹諾酮類抗菌藥之一的萘啶酸有抗性[14]。本研究選擇的7種藥物分別來自喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類和酰胺醇類，試驗(yàn)結(jié)果顯示基因缺失株對萘啶酸和選擇的其它藥物均高度敏感，與野生菌株是一致的，并未因基因的缺失而改變菌株的耐藥性。

綜上所述，雞白痢沙門菌基因缺失株S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA、S6702△rfaG△csgA△ompR和 S6702△rfaL△csgA△ompR均喪失了生物被膜形成能力，對環(huán)境的適應(yīng)能力下降，在酸、堿、54℃熱處理、紫外照射條件下均易被滅活，對兩種常用消毒劑聚維酮碘和過硫酸氫鉀也顯示出了較高的敏感性，具有良好的環(huán)境安全性，可以作為雞白痢沙門菌減毒候選疫苗株的潛力。