趙 翠，趙文萱，趙福廣

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130118)

幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，HP)感染仍然是全球性的問題，據(jù)不完全統(tǒng)計，全球有近50%的人口感染或攜帶HP。通常情況下采用抗生素和質(zhì)子泵抑制劑治療，但抗生素的耐藥性、治療費用昂貴、治愈后再復(fù)發(fā)等因素成為影響治療不可忽視的因素。治療性疫苗已經(jīng)成為攻克HP感染的必然趨勢，已 經(jīng)有 Urase[1]、VacA[2]、CagA[3]、HpaA[4]等作為HP疫苗抗原的研究設(shè)計，但這些疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及免疫效果有限。

lpp20基因的表達產(chǎn)物L(fēng)pp20是一種高度保守的外膜性脂蛋白，在細菌存活和宿主定植過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且具有良好的免疫活性[5]。近年來有研究顯示，Lpp20可以促進胃癌細胞的遷移和增殖[6]。cagA基因的表達產(chǎn)物CagA蛋白同樣是一種免疫原性較強，存在于菌體表面的外膜蛋白，不同毒力菌株之間的同源性高達80%以上，可以作為候選抗原刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)[7]。因此，本實驗選擇lpp20和cagA作為候選抗原基因，設(shè)計并構(gòu)建了表達融合蛋白的重組乳酸球菌(L.lactis)，以期提高抗HP感染的同時，為研究防治性HP疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料L.lactisNZ3900和表達載體pNZ8149由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院胡桂學(xué)教授惠贈；本實驗所用HP菌株分離自消化性胃潰瘍患者的胃黏膜中，經(jīng)鑒定為HP I型菌株(cagA+vacA+)；哥倫比亞選擇培養(yǎng)基、M17、Elliker培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；IFN-γ、IL-4、IgG、IgG1、IgG2a、SIgA ELISA檢測試劑盒、細菌基因組提取試劑盒均購自康維世紀有限公司；基因重組試劑盒購自中美泰和生物技術(shù)有限公司；Seamless Assembly Cloning kit購自中美泰和生物技術(shù)有限公司；聚合酶ExTaqHot Start Version購自TaKaRa生物技術(shù)有限公司；羊抗小鼠IgG-HRP購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；鼠抗重組L.lactis的抗血清由本實驗室制備；8周齡SPF級BALB/c雄性小鼠購自長春高新產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)實驗動物中心。

1.2 重組表達載體的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)GenBank中l(wèi)pp20(899837)和cagA(898927)基因序列設(shè)計無縫克隆引物P1/P2和P3/P4，所用引物均由長春庫美生物有限公司合成(表1)，其中加粗字體部分為載體同源臂，下劃線部分為柔性Linker GGGSGGGS序列。參照細菌基因組提取試劑盒說明方法提取HP基因組，并以此為模板，分別以P1/P2和P3/P4為引物，按照ExTaqHot Start Version說明方法擴增目的基因lpp20和cagA。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收產(chǎn)物。

表1 PCR引物序列

利用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XbaⅠ對表達載體pNZ8149進行線性化處理，采用無縫克隆技術(shù)，按照Seamless Assembly Cloning Kit說明方法將目的基因lpp20和cagA克隆于pNZ8149中，構(gòu)建重組質(zhì)粒 。將 10 μL重 組質(zhì)粒電轉(zhuǎn) 化 100 μLL.lactisNZ3900，利用Elliker選擇培養(yǎng)基篩選的陽性克隆子為金黃色。挑取陽性克隆子于M17培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，并由長春庫美生物有限公司測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pNZ8149-lpp20-cagA。

1.3 融合蛋白Lpp20-CagA的表達和反應(yīng)原性研究調(diào)整pNZ8149-lpp20-cagA/NZ3900重組菌株OD600nm為0.6，經(jīng) nisin(終濃度 20 μg/mL)誘導(dǎo)表達 4 h，離心收集菌體后，再由濃度為10 mg/mL的溶菌酶消化，離心取上清制備蛋白樣品。以鼠抗重組L.lactis的抗血清(1∶100)為一抗，羊抗小鼠 IgG-HRP(1∶5 000)為二抗進行western blot檢測。

1.4 融合蛋白Lpp20-CagA的免疫原性研究 將8周齡SPF級BALB/c雄性小鼠隨機分為6組，每組12只，即pNZ8149-lpp20-cagA/NZ3900(5×109cfu/mL)的高(1 000 μL)、中(500 μL)和低劑量組(250 μL)，全菌疫苗組(甲醛滅活 HP，5×109cfu/mL，1 000 μL)，pNZ149/NZ900 組(5×109cfu/mL，1 000 μL)，PBS 組(1 000 μL)。以上各組分別在第 0、7 d、14 d、21 d、28 d灌胃給藥，最后一次免疫后2周，對全部小鼠經(jīng)眼眶靜脈取血并制備血清，應(yīng)用相應(yīng)的ELISA試劑盒檢測各組小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a及細胞因子IL-4、IFN-γ水平；同時每組隨機選取6只小鼠迫殺，取其胃部組織、小腸及糞便，用無菌PBS勻漿處理后，離心取上清液，利用SIgA ELISA試劑盒檢測黏膜抗體SIgA水平。

1.5 HP攻毒試驗 將以上免疫后2周的所有小鼠均灌胃1 mL 5×109cfu/mL HP進行攻毒試驗，每隔3 d灌胃一次，共計5次，最后一次攻毒2周后，迫殺每組剩余的6只小鼠并分離胃組織。準確稱量胃組織，加入同等體積的無菌PBS緩沖液，對胃組織進行勻漿處理，離心吸取上清液200 μL，接種于哥倫比亞選擇培養(yǎng)基中，37℃微需氧條件下培養(yǎng)3 d完成HP的定量培養(yǎng)；同時，按照脲酶診斷試劑盒說明對胃組織中脲酶活性進行檢測。

1.6 數(shù)據(jù)分析 本實驗應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用單向方差分析比較各組數(shù)據(jù)的 差 異 性 ， 其 中 *：p＜0.05、 **：p＜0.01、 ***：p＜0.001有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pNZ8149-lpp20-cagA的構(gòu)建與鑒定結(jié)果 以HP基因組為模板，分別以P1/P2和P3/P4為引物擴增基因lpp20(528 bp)和cagA(843 bp)，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果與預(yù)期大小相符(圖1)。將以上目的基因的膠回收產(chǎn)物應(yīng)用無縫克隆試劑盒連接表達載體pNZ8149構(gòu)建pNZ8149-lpp20-cagA，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化L.lactisNZ3900，提取質(zhì)粒經(jīng)測序分析，結(jié)果顯示，插入基因片段與GenBank中相應(yīng)基因序列(lpp20Gene ID：899837、cagAGene ID：898927)同源性均為99%，表明表達載體pNZ8149-lpp20-cagA構(gòu)建正確。

2.2 融合蛋白Lpp20-CagA的反應(yīng)原性鑒定pNZ8149-lpp20-cagA/NZ3900經(jīng) 20 μg/mL 的 nisin誘導(dǎo)后進行western blot檢測，結(jié)果顯示，在約為50.3 ku處出現(xiàn)特異條帶，與預(yù)期相符(圖2)，表明本實驗表達的融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

2.3 融合蛋白Lpp20-CagA的免疫原性鑒定 在小鼠灌胃免疫本實驗制備的重組L.lactis后，應(yīng)用ELISA試劑盒對各組小鼠血清中特異性抗體及細胞因子水平進行檢測。結(jié)果顯示，IL-4在實驗組(pNZ8149-lpp20-cagA/NZ3900的高劑量組、中劑量組，低劑量組)和PBS組相比呈現(xiàn)顯著差異(p＜0.001或p＜0.05)，但是IFN-γ水平在各實驗組和PBS組之間無差異性 (p＞0.05)(圖3)。另外，IgG、IgG1在實驗組與PBS組比較差異顯著(p＜0.001或p＜0.05)(圖4A、B)，但IgG2a的實驗組和PBS組比較無差異性(p＞0.05)(圖4C)。黏膜抗體SIgA檢測結(jié)果顯示，在胃黏膜和小腸黏膜中，高劑量組和中劑量組與PBS組相比呈現(xiàn)顯著差異(p＜0.05)，在糞便中，高中低3個劑量組與PBS組相比均呈現(xiàn)顯著差異(p＜0.05)(圖4D)。綜合以上，本實驗表達的融合蛋白Lpp20-CagA具有良好的免疫原性，可以誘導(dǎo)體液免疫和黏膜免疫應(yīng)答。

2.4 HP攻毒試驗結(jié)果 最后一次攻毒后2周迫殺小鼠，對小鼠胃組織中HP的定量培養(yǎng)及脲酶活性進行檢測，結(jié)果顯示，高劑量組相比于PBS組差異極顯著(p＜0.001)，高劑量組相比于全菌疫苗組差異顯著(p＜0.01)(圖5)。以上結(jié)果顯示本實驗構(gòu)建的重組L.lactis可以減少HP在小鼠胃組織中的定植，尤其以高劑量組的效果最為顯著。表明本實驗構(gòu)建的重組L.lactis可以抵抗HP的感染。

3 討論

本實驗所采用的L.lactis是異源蛋白在適宜條件下表達的常用宿主，其無毒的特性優(yōu)于其它疫苗載體。Zhang Hong-xin等以L.lactis作為疫苗載體，表達了融合蛋白ureB-IL-2，結(jié)果顯示該載體疫苗可以誘導(dǎo)較高水平的特異性抗體反應(yīng)，且小鼠胃組織中HP的負荷及脲酶活性相比于對照組顯著降低[8]，相似的結(jié)果也體現(xiàn)在Zhang Rong-guang等的研究中[5]。這表明L.lactis作為抗原遞呈載體的巨大潛力，但小鼠胃組織中仍然存在一定數(shù)量的HP并未完全清除，是以上兩個研究的共同之處，這也與本研究結(jié)果一致。

本實驗在L.lactis中表達了融合蛋白Lpp20-CagA，western blot結(jié)果表明，該融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性。以pNZ8149-lpp20-cagA/NZ3900對小鼠實施免疫保護性試驗，其血清中IL-4與PBS組相比差異顯著，但IFN-γ與PBS組相比并無差異性。IFN-γ和IL-4分別是Th1型和Th2型細胞分化的標志，細胞因子的檢測結(jié)果表明本實驗表達的融合蛋白誘導(dǎo)了以Th2型免疫為主的體液免疫應(yīng)答模式，而HP的清除與體液免疫和細胞免疫高度相關(guān)，在參與對抗胞外病原體以及HP感染中發(fā)揮了重要作用，這或許是HP不能完全被根除的原因所在。在評估血清中特異性抗體方面，IgG1/IgG2a是評估Th1/Th2之間平衡的重要指標，IgG2a在組別之間無任何差異性，從側(cè)面驗證了融合蛋白Lpp20-CagA誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答的結(jié)論。Liu Kai-yun等以CagA、VacA、UreB作為抗原表達融合蛋白，在檢測特異性抗體方面，IgG2a的表達水平在實驗組與PBS組之間差異顯著，相反IgG1在任何組別無差異，表明Liu Kai-yun等表達的融合蛋白誘導(dǎo)了以Th1型為主的細胞免疫應(yīng)答[3]，此研究結(jié)果有別于本實驗的研究結(jié)果。造成結(jié)果不同的原因可能是不同抗原組合表達的融合蛋白誘導(dǎo)不同的免疫類型。最后對小鼠進行HP攻毒，胃組織中HP的定植密度及脲酶活性檢測結(jié)果均顯示，與PBS組相比，高劑量組的HP負荷量顯著降低。但同時發(fā)現(xiàn)，即使在高劑量組，小鼠胃黏膜中仍有一定數(shù)量的HP定植并未完全根除，這也是目前為止，中外學(xué)者面臨的共同難題[9-10]。

綜合以上，口服重組L.lactis在對抗HP感染方面是安全有效且其具有較強的免疫原性，也證實了L.lactis作為抗原遞呈載體的有效性，其潛在應(yīng)用價值不容忽視。