郭玉錦，濮義福，朱興旺，盧少明

(山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院，濟(jì)南 250000)

近年來，不孕不育的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐漸上升，已婚育齡夫婦的不孕不育癥發(fā)生率約在15%左右，其中約40%～50%是由于男方因素引起[1]。1976年Tiepolo等[2]首先發(fā)現(xiàn)人類Y染色體的長臂1區(qū)1帶(q11)上有影響精子生成的無精子因子(azoospermia factor，AZF)的存在，將其命名為AZF家族，AZF區(qū)域中出現(xiàn)的任何缺失改變都可導(dǎo)致男性出現(xiàn)嚴(yán)重少精子癥甚至無精子癥[3]，近年來已成為生殖醫(yī)學(xué)男科研究中的熱點(diǎn)。研究表明男性因素中Y染色體微缺失與男性不育密切相關(guān)，是繼先天性曲細(xì)精管發(fā)育不完全綜合征(又稱Klinefelter綜合征)后導(dǎo)致男性生精障礙的第二大遺傳學(xué)病因[4]，并以美國和東亞不育男性的患病率最高[5]。雖然AZF的微缺失可導(dǎo)致男性不育，但是否會(huì)影響其所致的嚴(yán)重少精子癥患者行ICSI-ET助孕的胚胎情況及妊娠結(jié)局，目前各研究結(jié)論不盡相同。本研究回顧性分析了我院2010年1月至2013年12月因男方嚴(yán)重少精子癥為指征就診，行ICSI-ET助孕的630對夫婦ICSI助孕的結(jié)局，根據(jù)Y染色體有無缺失改變將患者分為缺失組和對照組，統(tǒng)計(jì)并分析Y染色體微缺失對胚胎發(fā)育及移植后妊娠結(jié)局的影響。

資料和方法

一、研究對象及分組

收集因男方嚴(yán)重少精子癥為指征于2010年1月至2013年12月間在本院行ICSI-ET助孕的夫婦，入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫妻性生活正常、未采取避孕措施1年以上女方未孕；(2)女方年齡≤40歲，基礎(chǔ)內(nèi)分泌性激素水平正常并排除女方不孕因素，無子宮畸形、無子宮內(nèi)膜異位癥、無輸卵管疾病、無多囊卵巢綜合征、無盆腔粘連、無家族遺傳病史等；(3)夫婦均進(jìn)行染色體核型分析，排除有生育禁忌的染色體結(jié)構(gòu)及數(shù)量的畸變；(4)男方均行Y染色體微缺失的檢測；(5)促排卵中女方卵巢反應(yīng)正常。

并根據(jù)Y染色體是否存在微缺失改變將患者分為缺失組和對照組。缺失組167例(共184個(gè)ICSI周期)：檢測顯示存在Y染色體微缺失[其中AZFb缺失2例，AZFc缺失5例，AZFd缺失5例，AZF(c+d)缺失154例，AZF(b+c+d)缺失1例]，無其他導(dǎo)致嚴(yán)重少精子癥的情況；對照組463例(共528個(gè)ICSI周期)：檢測為無Y染色體微缺失，因其他原因所致的嚴(yán)重少精子癥。

二、研究方法

1.精液分析：使用世界衛(wèi)生組織(WHO)精液評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：每位男性患者1～2個(gè)月內(nèi)進(jìn)行3次精液檢測，每次檢測禁欲3～7 d，精子濃度<5×106/ml者為嚴(yán)重少精子癥。所有的精液分析均在同一實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

2.Y染色體微缺失的檢測：我院生殖中心分子遺傳實(shí)驗(yàn)室采用多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，檢測Y染色體AZF基因家族9個(gè)序列標(biāo)記位點(diǎn)(STS)：SY84和SY86(AZFa)，RBM1、SY127和SY134(AZFb)，SY254和SY255(AZFc)，SY152和SY153(AZFd)；設(shè)置鋅指結(jié)構(gòu)基因(ZFX/ZFY)和Y染色體性別決定基因(SRY)作為內(nèi)參，并和這9個(gè)STS位點(diǎn)分為3組(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組)進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，M為標(biāo)記片段(Marker)，以空白及正常女性做對照。具體如圖1所示，空白對照無基因條帶；正常女性對照僅有ZFX基因條帶；正常生育男性對照含有ZFX/ZFY和SRY基因條帶以及9個(gè)序列標(biāo)記位點(diǎn)基因條帶；樣本示例為AZF(c+d)缺失(無SY254、SY255和SY152、SY153標(biāo)記位點(diǎn)條帶)。對發(fā)現(xiàn)存在微缺失的樣本重復(fù)進(jìn)行2次PCR檢測，如果仍無擴(kuò)增信號(hào)，則說明此Y染色體區(qū)域有微缺失。

3.遺傳咨詢：攜帶Y染色體微缺失改變的夫婦在接受ICSI-ET助孕之前接受了詳細(xì)的遺傳咨詢，并被告知：由于Y染色體微缺失可垂直傳遞，因此自精助孕所產(chǎn)生的男性后代可能會(huì)遺傳父源Y染色體微缺失，可能會(huì)面臨同樣的生育問題；可選擇行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(PGT)進(jìn)行醫(yī)療性性別選擇或選擇供精人工授精(AID)，并告知患者整個(gè)助孕過程中有可能發(fā)生的其他相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，患者夫婦雙方均事先表示知情同意，并簽署ICSI助孕相關(guān)知情同意書。

正常女性對照僅有ZFX基因條帶；正常生育男性對照含有ZFX/ZFY、SRY及9個(gè)STS基因條帶；樣本示例缺失SY254、SY255和SY153、SY152位點(diǎn)條帶，為AZF(c+d)缺失圖1 多重PCR電泳檢測圖

4.女方助孕方案：均采用常規(guī)長方案促排卵，在女方排卵后1周左右(相當(dāng)于月經(jīng)周期21 d)開始使用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)長效制劑達(dá)菲林(益普生，法國)或者達(dá)必佳(默克雪蘭諾，瑞士)1.25～1.88 mg進(jìn)行垂體降調(diào)，14 d后復(fù)查，降調(diào)滿意后根據(jù)患者情況啟動(dòng)促性腺激素(Gn)果納芬(默克雪蘭諾，瑞士)促進(jìn)卵泡發(fā)育和成熟，B超動(dòng)態(tài)監(jiān)測女方的卵泡發(fā)育情況，卵泡發(fā)育至大小1.6～1.8 cm且卵泡數(shù)≥3個(gè)時(shí)，肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠集團(tuán))，36～38 h后在陰道B超引導(dǎo)下進(jìn)行穿刺取卵。

5.取精方式：男方患者禁欲2～7 d后在女方取卵當(dāng)天進(jìn)行取精，方式為手淫取精。

6.胚胎實(shí)驗(yàn)室處理：手淫取精的精液處理采用密度梯度離心法，在顯微鏡400倍放大倍數(shù)視野下挑選形態(tài)相對正常的可利用精子。卵母細(xì)胞在培養(yǎng)液中充分洗滌后置于受精液G-IVF(Vitrolife，瑞典)中預(yù)培養(yǎng)約3 h，用透明質(zhì)酸酶消化,去除顆粒細(xì)胞后的卵母細(xì)胞置于G1培養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)0.5 h，將準(zhǔn)備好的精子注射入成熟卵母細(xì)胞(MⅡ)中，觀察卵母細(xì)胞受精情況，取卵后第1天觀察到兩原核(2PN)者為正常受精卵，取卵第3天選擇評(píng)分較高的卵裂期胚胎1～3枚進(jìn)行移植。

7. 觀察指標(biāo)：胚胎移植后2周檢查血清β-HCG，若≥25 U/L為HCG陽性；于移植后5周行陰道超聲檢查，可見到孕囊者為臨床妊娠。異位妊娠指發(fā)生在子宮腔以外的妊娠；早期流產(chǎn)為妊娠12周以前發(fā)生的妊娠終止現(xiàn)象；晚期流產(chǎn)為發(fā)生在妊娠12周至不足28周者；早產(chǎn)是指妊娠滿28周但不足37周間的分娩；活產(chǎn)為至少生產(chǎn)1個(gè)≥28周的活產(chǎn)兒。

其中，受精率=2PN數(shù)/MⅡ卵母細(xì)胞數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；早期流產(chǎn)率=妊娠12周前流產(chǎn)的周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；晚期流產(chǎn)率=妊娠12周后流產(chǎn)的周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；早產(chǎn)率=早產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；后代男女比例=出生男嬰數(shù)/出生女嬰數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、缺失組和對照組一般情況比較

缺失組和對照組夫婦中女方年齡、男方年齡、女方基礎(chǔ)FSH、女方體重指數(shù)(BMI)、MⅡ卵母細(xì)胞數(shù)、2PN數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎總數(shù)、HCG日內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、缺失組和對照組妊娠結(jié)局比較

缺失組患者的受精率(62.7%)顯著低于對照組(67.8%)(P<0.01)；兩組患者的優(yōu)質(zhì)胚胎率(53.0% vs.50.7%)、臨床妊娠率(49.5% vs. 51.7%)、異位妊娠率(0.5% vs. 0.9%)、早期流產(chǎn)率(5.4% vs. 2.8%)、晚期流產(chǎn)率(3.3% vs. 3.0%)、早產(chǎn)率(3.8% vs. 6.4%)、活產(chǎn)率(40.2% vs. 44.9%)、后代男女比例(1.13 vs. 1.09)比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

組 別周期數(shù)女方年齡男方年齡女方基礎(chǔ)FSH(U/L)女方BMI(kg/m2)MⅡ卵母細(xì)胞數(shù)缺失組18428.22±3.6429.79±4.186.70±1.2522.18±2.7412.47±4.65對照組52828.53±3.1833.14±3.966.73±1.6122.30±2.7412.28±5.43組 別周期數(shù)2PN受精數(shù)優(yōu)質(zhì)胚胎總數(shù)移植胚胎數(shù)HCG日內(nèi)膜厚度(cm)缺失組1847.82±4.014.15±2.912.01±0.411.13±0.15對照組5288.33±4.374.22±3.112.04±0.451.13±0.21

注：與對照組比較，*P<0.05

討 論

目前對于男性不育的遺傳學(xué)病因研究越來越多，其中Y染色體微缺失較為常見[6]。已有研究表明AZF微缺失在嚴(yán)重少精子癥及無精子癥患者中發(fā)病率約為10%[7]。1996年Vogt等[8]將AZF區(qū)分為3個(gè)區(qū)域，分別命名為AZFa、AZFb和AZFc區(qū)，這3個(gè)區(qū)域互不重疊，均可能發(fā)生微小缺失的改變，從而造成不同程度的男性睪丸生精功能障礙，導(dǎo)致男性患有嚴(yán)重少精子癥甚至無精子癥。Kent-First等[9]通過研究于1999年提出在Y染色體的AZFb區(qū)與AZFc區(qū)之間存在AZFd區(qū)，同樣AZFd區(qū)的缺失可導(dǎo)致男性不育。隨著輔助生殖技術(shù)的快速發(fā)展，嚴(yán)重少精子癥患者可通過ICSI-ET技術(shù)獲得自己的后代，同時(shí)借助輔助生殖技術(shù)出生的后代情況也受到越來越多人的關(guān)注，Y染色體微缺失是否影響其受精率、胚胎質(zhì)量、繼續(xù)妊娠能力等妊娠結(jié)局，目前的研究仍存在爭議。

本研究在夫妻雙方如男女方年齡、女方基礎(chǔ)FSH、女方BMI、卵母細(xì)胞數(shù)等比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)的情況下，比較了有Y染色體微缺失與無Y染色體微缺失的嚴(yán)重少精子癥患者的胚胎正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、早產(chǎn)率、活產(chǎn)率、后代男/女比例等指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失組的受精率顯著低于對照組(P<0.01)，但兩組患者的優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率等妊娠結(jié)局指標(biāo)比較無顯著性差異(P>0.05)。推測其可能原因?yàn)椋篩染色體微缺失會(huì)使精子的受精能力降低，從而無法激活卵母細(xì)胞，導(dǎo)致行ICSI助孕的正常受精率降低，但尚未影響其妊娠結(jié)局，提示精卵一旦成功受精，胚胎發(fā)育將不受Y染色體微缺失的影響，形成優(yōu)質(zhì)胚胎及繼續(xù)妊娠的能力兩組間并無明顯差異。與van Golde等[10]、Liu等[11]研究提出的Y染色體微缺失組的受精率明顯低于無Y染色體微缺失組的結(jié)論相同。也有學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)兩組的受精率并無差異[12-15]，這提示我們需要更大的樣本量進(jìn)一步研究Y染色體微缺失改變與胚胎異常受精有無直接關(guān)系。

Y染色體的完整性與否對于維持胚胎的繼續(xù)妊娠能力有無影響，國內(nèi)外學(xué)者目前的研究結(jié)論不盡相同，仍存在較大爭議[16-17]，Mateu等[18]研究表明Y染色體微缺失的患者其精子發(fā)生非整倍體比例會(huì)增高，導(dǎo)致出現(xiàn)較多的非整倍體胚胎，從而增加了其早期流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。肖宗輝等[19]的研究數(shù)據(jù)亦顯示Y染色體微缺失組患者的早期流產(chǎn)率及晚期流產(chǎn)率顯著高于未缺失組，提示Y染色體微缺失可能會(huì)增加患者的流產(chǎn)率。但Wettasinghe等[20]則認(rèn)為Y染色體的微缺失與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生并無關(guān)系，郭麗[21]、Zhu等[22]研究結(jié)論則認(rèn)為Y染色體的微缺失并不影響其配偶的繼續(xù)妊娠，與流產(chǎn)無關(guān)。本研究數(shù)據(jù)顯示缺失組早期流產(chǎn)率及晚期流產(chǎn)率有高于對照組的趨勢，但差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示我們后續(xù)需要進(jìn)行更大樣本量的研究來進(jìn)一步探討Y染色體微缺失與維持胚胎發(fā)育和繼續(xù)妊娠之間的關(guān)系。

本研究數(shù)據(jù)顯示兩組后代男女性別比例相近，組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與之前部分文獻(xiàn)報(bào)道較一致。Komori等[23]認(rèn)為ICSI助孕技術(shù)可以幫助Y染色體微缺失的患者獲得后代的同時(shí)也會(huì)將Y染色體微缺失傳遞給男性后代，導(dǎo)致男性后代同樣不育，而不會(huì)提高女性后代不孕的風(fēng)險(xiǎn)，并且男性后代可能出現(xiàn)Y染色體微缺失片段長度長于其父親，即出現(xiàn)擴(kuò)大傳遞現(xiàn)象。因此建議嚴(yán)重少精子癥的的不育男性進(jìn)行Y染色體微缺失檢測，對于患有Y染色體微缺失的患者，以便夫妻雙方能夠做出明智的選擇是否行PGT選擇女性胚胎移植或改行AID助孕[5]。但對于Y染色體微缺失擴(kuò)大傳遞的具體數(shù)據(jù)鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，需進(jìn)一步行隊(duì)列隨訪研究。

綜上所述，Y染色體微缺失引起的嚴(yán)重少精子癥患者在ICSI-ET治療結(jié)局中，胚胎正常受精率會(huì)明顯降低，但最終的妊娠結(jié)局并未受到影響，且子代的男/女比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？紤]到Y(jié)染色體微缺失的垂直傳遞會(huì)使其男性后代面臨同樣的生育問題，行PGT選擇女性胚胎移植或AID的助孕方式可以切斷Y染色體微缺失的遺傳途徑，所以Y染色體微缺失的男性患者面臨不育問題時(shí)可建議其行遺傳咨詢選擇助孕方式，達(dá)到后代優(yōu)生優(yōu)育的目的。