王曉尉，谷翊群，周芳，梁小薇，許劍鋒，盧文紅

(國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081)

精液參數(shù)是診斷男性疾病、以及治療效果評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一，同時(shí)也對(duì)評(píng)估男性生育力有著重要作用。多年來(lái)，精液參數(shù)評(píng)估方法多、技術(shù)要求高，操作很難標(biāo)準(zhǔn)化。因此，各個(gè)男科實(shí)驗(yàn)室以及相關(guān)機(jī)構(gòu)都對(duì)自己的人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室操作的內(nèi)部質(zhì)量控制，以保證實(shí)驗(yàn)人員操作技術(shù)規(guī)范、檢驗(yàn)結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性。

雖然，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)于人員操作技術(shù)的規(guī)范相當(dāng)重視，但卻經(jīng)常忽略相關(guān)實(shí)驗(yàn)儀器準(zhǔn)確性的校準(zhǔn)。誤差的來(lái)源并不完全來(lái)自于操作者本身，儀器的誤差也是檢測(cè)結(jié)果誤差的來(lái)源之一，尤其是現(xiàn)在各大三甲醫(yī)院幾乎都在使用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)，對(duì)于儀器的準(zhǔn)確性判斷更是勢(shì)在必行。

精子濃度一直是精液常規(guī)檢測(cè)中問(wèn)題比較大的一個(gè)指標(biāo)。Makler計(jì)數(shù)板和CASA是實(shí)驗(yàn)室最常用的兩個(gè)計(jì)數(shù)精子的儀器，但是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期使用的Makler計(jì)數(shù)板，其腔室容積會(huì)發(fā)生變化，CASA對(duì)于精子的捕捉是否準(zhǔn)確，這些都是我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中無(wú)法預(yù)知的，并且這些因素都有可能對(duì)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。根據(jù)《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第五版手冊(cè)相關(guān)質(zhì)控方法的介紹，我們總結(jié)了一些評(píng)估方法，探討這些方法能否評(píng)估儀器的準(zhǔn)確性。

資料與方法

一、研究對(duì)象

精液樣本：北京人類精子庫(kù)20例新鮮志愿者精液樣本。樣本采集見(jiàn)文獻(xiàn)[1]。所有志愿者簽署知情同意書(shū)。

混合精液質(zhì)控品：對(duì)收集的液化和粘稠度都正常的精液樣本進(jìn)行充分混勻后，分裝成10支，每支500 μl，作為濃度的質(zhì)控樣本。

質(zhì)控珠：QC-BeadsTM質(zhì)控珠(Bioscreen，美國(guó))。

二、研究方法

1.精子濃度計(jì)數(shù)要求：利用改良Neubauer計(jì)數(shù)板、Makler計(jì)數(shù)板進(jìn)行人工分析，以及用CASA進(jìn)行自動(dòng)分析。其中利用改良Neubauer計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)精子遵循《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第五版(以下簡(jiǎn)稱“第五版”手冊(cè))的要求進(jìn)行，Makler計(jì)數(shù)板和CASA計(jì)數(shù)則遵循儀器使用規(guī)范的要求進(jìn)行計(jì)數(shù)，CASA計(jì)數(shù)時(shí)所用的載體為自帶的10 μl深計(jì)數(shù)池。具體實(shí)驗(yàn)操作的技術(shù)員必須經(jīng)過(guò)第五版手冊(cè)相關(guān)技術(shù)的培訓(xùn)，并能夠熟練使用改良Neubauer計(jì)數(shù)板、Makler計(jì)數(shù)板以及CASA對(duì)精子進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.混合精液質(zhì)控品評(píng)估：分別用改良Neubauer計(jì)數(shù)板、全新購(gòu)置的Makler計(jì)數(shù)板(簡(jiǎn)稱“新Makler計(jì)數(shù)板”)和使用超過(guò)7年的Makler計(jì)數(shù)板(簡(jiǎn)稱“舊Makler計(jì)數(shù)板”)進(jìn)行評(píng)估，將改良Neubauer計(jì)數(shù)板評(píng)估的精子濃度值作為標(biāo)準(zhǔn)，分別和新舊Makler計(jì)數(shù)板所及結(jié)果進(jìn)行比較。

3.質(zhì)控珠評(píng)估：利用新Makler計(jì)數(shù)板和舊Makler計(jì)數(shù)板分別對(duì)高(53～67×106/ml)、低濃度(25～34×106/ml)質(zhì)控珠樣本分別進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估得到的結(jié)果與質(zhì)控珠給定的靶值范圍繪制Youden圖[2]，并對(duì)新、舊Makler計(jì)數(shù)板評(píng)估結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

4.多份新鮮精液樣本評(píng)估：利用改良Neubauer計(jì)數(shù)板、Makler計(jì)數(shù)板以及CASA對(duì)20份新鮮精液樣本的濃度進(jìn)行評(píng)估，將改良Neubauer計(jì)數(shù)板評(píng)估的濃度值作為標(biāo)準(zhǔn)，所得到的結(jié)果繪制Bland-Altman圖[3-4]。

5.評(píng)估準(zhǔn)確性控制：進(jìn)行混合精液樣本和質(zhì)控珠的評(píng)估時(shí)，為了減少人為因素引入的誤差，每次檢測(cè)都要進(jìn)行兩次計(jì)數(shù)，并進(jìn)行差異的一致性檢驗(yàn)。對(duì)每個(gè)樣本要進(jìn)行多次(不少于10次)的檢測(cè)。多份新鮮精液樣本的評(píng)估[1]，每份樣本檢測(cè)都要進(jìn)行兩次計(jì)數(shù)，并進(jìn)行差異一致性檢驗(yàn)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。利用單因素方差分析、Youden圖、Bland-Altman圖以及配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)新舊Makler計(jì)數(shù)板以及CASA檢測(cè)的濃度結(jié)果進(jìn)行分析，并檢測(cè)差異性結(jié)果。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同計(jì)數(shù)板對(duì)混合精液質(zhì)控品的計(jì)數(shù)結(jié)果

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，不同計(jì)數(shù)板對(duì)同一份混合精液質(zhì)控品的濃度連續(xù)檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)(CV)均小于10%；與舊Makler計(jì)數(shù)板相比，新Makler計(jì)數(shù)板(P=0.006)和改良Neubauer計(jì)數(shù)板(P=0.03)均有顯著性差異，而改良Neubauer計(jì)數(shù)板與新Makler計(jì)數(shù)板沒(méi)有顯著性差異(P=1.0)(表1)。

表1 不同計(jì)數(shù)板對(duì)同一份混合精液質(zhì)控品連續(xù)進(jìn)行10次評(píng)估結(jié)果(×106/ml)和單因素方差分析結(jié)果

注：與舊Makler計(jì)數(shù)板相比，*P<0.05

二、質(zhì)控珠計(jì)數(shù)結(jié)果

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，濃度連續(xù)濃度計(jì)數(shù)結(jié)果變異系數(shù)(CV)均小于10%，不論是高濃度(P=0.002 5)還是低濃度(P=0.009)，新、舊兩個(gè)計(jì)數(shù)板所評(píng)估的結(jié)果都有顯著性差異(表2)。根據(jù)質(zhì)控珠給定的靶值范圍，繪制Youden圖，可以看出有部分點(diǎn)偏出了靶值范圍，但是，所有點(diǎn)的分布相對(duì)比較集中，散點(diǎn)偏離靶值范圍的距離并不遠(yuǎn)(圖2)。

表2 不同計(jì)數(shù)板對(duì)同一份質(zhì)控珠樣本連續(xù)進(jìn)行10次評(píng)估結(jié)果(×106/ml)和單因素方差分析

注：與同濃度新Makler計(jì)數(shù)板相比，*P<0.05

圖1 顯微鏡下改良Neubauer計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)質(zhì)控珠

●圓點(diǎn)代表新Makler計(jì)數(shù)板評(píng)估結(jié)果；▲三角代表舊Makler計(jì)數(shù)板評(píng)估結(jié)果圖2 新、舊Makler計(jì)數(shù)板評(píng)估質(zhì)控珠結(jié)果的Youden圖

三、20份新鮮精液樣本評(píng)估結(jié)果

A：改良繪制方法；B：傳統(tǒng)繪制方法圖3 改良Neubauer計(jì)數(shù)板vs. 舊Makler計(jì)數(shù)板的精子濃度計(jì)數(shù)Bland-Altman圖

A：改良繪制方法；B：傳統(tǒng)繪制方法圖4 改良Neubauer計(jì)數(shù)板vs. CASA精子濃度計(jì)數(shù)的Bland-Altman圖

對(duì)20份新鮮精液樣本計(jì)數(shù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示與改良Neubauer計(jì)數(shù)板相比，舊Makler計(jì)數(shù)板沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，CASA有顯著性差異(P<0.05)(表3)。驗(yàn)證了Bland-Altman圖改進(jìn)方法判斷的準(zhǔn)確性。

表3 改良Neubauer計(jì)數(shù)板、舊Makler計(jì)數(shù)板和CASA對(duì)20份樣本檢測(cè)結(jié)果(×106/ml)

注：與改良Neubauer計(jì)數(shù)板相比，*P<0.05

討 論

文中實(shí)驗(yàn)均依據(jù)第五版手冊(cè)要求進(jìn)行操作，其中改良Neubauer計(jì)數(shù)板評(píng)估濃度按照第五版計(jì)數(shù)方法要求完成，Makler計(jì)數(shù)板和CASA則按照相關(guān)規(guī)則進(jìn)行計(jì)數(shù)，但也要按照手冊(cè)要求每次或每個(gè)樣本至少計(jì)數(shù)兩次，并進(jìn)行一致性分析。

通常男科實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行校準(zhǔn)設(shè)備所用的質(zhì)控樣本有兩種，一個(gè)是質(zhì)控珠，另一個(gè)是自制的精液質(zhì)控品。對(duì)于兩種質(zhì)控品對(duì)設(shè)備準(zhǔn)確性評(píng)估效果，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中做了對(duì)比。為保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，我們每個(gè)濃度都進(jìn)行重復(fù)10次檢測(cè)，以減少實(shí)驗(yàn)人員操作所帶來(lái)的誤差。在用自制的混合精液質(zhì)控品中，以改良Neubauer計(jì)數(shù)板評(píng)估結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估結(jié)果進(jìn)行One-way ANOVA進(jìn)行分析 (表1)。而質(zhì)控珠結(jié)果也同樣方法進(jìn)行計(jì)數(shù)(表 2)，但我們并沒(méi)有對(duì)比改良Neubauer計(jì)數(shù)板的結(jié)果。首先，質(zhì)控珠直徑較小，在計(jì)數(shù)板內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間不沉降(圖1)，導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。其次，質(zhì)控珠本身給定了靶值范圍，沒(méi)必要再用改良Neubauer計(jì)數(shù)板計(jì)算質(zhì)控區(qū)間。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看，無(wú)論是使用質(zhì)控珠還是自制精液質(zhì)控品，新、舊Makler計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)比都有顯著差異。而用自制精液質(zhì)控品，新Makler計(jì)數(shù)板與改良Neubauer計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)濃度結(jié)果卻沒(méi)有顯著差異。陸金春等[17]學(xué)者發(fā)現(xiàn)在精子濃度分析中，精子計(jì)數(shù)池的深度非常關(guān)鍵，使用不合格的計(jì)數(shù)板，將導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生誤差，這種誤差和計(jì)數(shù)板深度誤差成正比。因此我們推斷，Makler計(jì)數(shù)板長(zhǎng)期使用其準(zhǔn)確度是有一定變化的。

實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)，由于質(zhì)控珠給定的靶值范圍偏大，雖然舊Makler計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)濃度結(jié)果有部分不在靶值范圍內(nèi)，但新、舊計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)結(jié)果在Youden圖(圖2)中的點(diǎn)卻很集中，并且超出靶值范圍并不遠(yuǎn)，從圖中我們并不能明顯看出兩塊計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)結(jié)果的差異，但是從統(tǒng)計(jì)結(jié)果上看(表2)卻有顯著性差異。因此，我們更推薦男科實(shí)驗(yàn)室用自制的混合精液質(zhì)控品進(jìn)行Makler計(jì)數(shù)板的質(zhì)控。自制質(zhì)控品成本很低，而且容易獲得，可以利用改良Neubauer計(jì)數(shù)板做靶值范圍進(jìn)行質(zhì)控，但是在使用過(guò)程中要注意分裝和取樣時(shí)精液要混勻。若需要用質(zhì)控珠進(jìn)行評(píng)估，必須配合相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，而不能直接使用給定靶值范圍。

Bland-Altman方法是一種介于定量和定性之間的方法，它可以用于判斷兩種方法或兩個(gè)人測(cè)量結(jié)果的一致性。WHO第五版手冊(cè)里推薦用此種方法分析和報(bào)告2名技術(shù)員之間的差異。這種方法最大的好處就是采用圖示的方法，很直觀的顯示出判斷結(jié)果。但是，很多人都忽略了Bland-Altman方法是有適用條件的[5]。對(duì)于傳統(tǒng)的繪制方法，首先，差值的平均趨勢(shì)在測(cè)量范圍內(nèi)保持不變，表現(xiàn)為圖中散點(diǎn)分布與X軸平行；第二，差值的散布程度在測(cè)量范圍內(nèi)保持一致，表現(xiàn)為圖中的散點(diǎn)分布在同寬的離散帶內(nèi)，即方差齊同；第三，差值的分布呈正態(tài)分布[6]。只有滿足這三個(gè)條件，我們才能認(rèn)為數(shù)據(jù)是良好的。否則直接使用Bland-Altman方法，不但得不到我們想要的真實(shí)結(jié)果，反而浪費(fèi)了大量的數(shù)據(jù)[7，12]。

從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于Bland-Altman方法改進(jìn)是有一定效果的，但是前提是確保我們改進(jìn)后的方法也要滿足Bland-Altman方法的使用條件，該方法的使用要靈活、要符合本行業(yè)的實(shí)際情況[13-16]，切不可生搬硬套。

Makler計(jì)數(shù)板作為男科實(shí)驗(yàn)室常用的手工計(jì)數(shù)工具，很少有人關(guān)注其腔室深度的變化對(duì)精子計(jì)數(shù)結(jié)果的影響，而國(guó)內(nèi)只有陸金春等[17]少數(shù)學(xué)者用Geoffrey精子計(jì)數(shù)池證明了二者的相關(guān)性。但是，實(shí)驗(yàn)只用了質(zhì)控珠，而沒(méi)有用精液樣本，因此，其結(jié)果有一定的局限性。我們用兩種質(zhì)控品進(jìn)行了對(duì)比，用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更全面的闡述了哪種質(zhì)控品更適合男科實(shí)驗(yàn)室。CASA對(duì)比手工實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，國(guó)內(nèi)做的很多[18-20]，大多數(shù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析得到結(jié)果，雖然結(jié)果有說(shuō)服力，但是不夠直觀，也無(wú)法顯示更多細(xì)節(jié)，例如，有多少組數(shù)據(jù)偏差比較大，CASA在哪個(gè)濃度范圍內(nèi)測(cè)量比較準(zhǔn)確等數(shù)據(jù)。Bland-Altman圖在治療方法和試劑盒檢測(cè)結(jié)果對(duì)比方面應(yīng)用非常廣泛[13]，但是，在男科領(lǐng)域目前國(guó)內(nèi)很少引用這種方法，盧文紅等[2]將這種方法引入男科實(shí)驗(yàn)室人員質(zhì)控，而利用這種方法對(duì)儀器進(jìn)行質(zhì)控和校準(zhǔn)的，國(guó)內(nèi)目前還是空白，我們希望通過(guò)這些方法能夠?yàn)閺V大的男科實(shí)驗(yàn)室人員對(duì)相應(yīng)的儀器質(zhì)控和校準(zhǔn)提供方法上的借鑒。