王 寧，楊春菊，何麗囡，樊保敏，曾廣智，尹俊林

(云南民族大學 云南民族大學-香港浸會大學傳統(tǒng)天然藥物研發(fā)聯(lián)合實驗室,云南 昆明 650500)

青蒿素(artemisinin)是一種來源于黃花青蒿(ArtemisiaannuaL.)的含過氧橋的倍半萜內(nèi)酯，其被廣泛用來治療多藥耐藥株惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)引起的瘧疾[1].近些年來的研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物可以抑制腫瘤細胞，包括人白血病細胞株[2]、結腸癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟癌細胞系，其中對白血病和結腸癌細胞株具有較高的抑制活性[3].

彌散性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphomas，DLBCL)是一種主要發(fā)生在淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，是非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin造血系統(tǒng)的惡性腫瘤 L，NHL)中的一種主要亞型，約占所用非霍奇金淋巴瘤的三分之一[4].彌散性大B細胞淋巴瘤主要有3種亞型，分別為預后較好的表達正常生發(fā)中心B細胞特征基因的生發(fā)中心B細胞樣型(GCB)；預后較差，表達活化的外周血B細胞和漿細胞特征基因的活化B細胞型樣(ABC)；第3型為無明確特征的異源性類型，預后較差.目前，使用標準的一線治療方案利妥昔單抗+CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松)后，DLBCL 患者的 4 年總生存率為 60%～70%，但仍有30% 的患者產(chǎn)生耐藥或復發(fā)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[5]，因此急需尋找新的治療藥物來提高復發(fā)難治性DLBCL 患者的生存率.

陽離子轉(zhuǎn)運蛋白樣蛋白1(CHAC1)是細菌、酵母和哺乳動物細胞中高度保守的蛋白質(zhì)，據(jù)報道CHAC1是ATF4/ATF3/CHOP途徑下游的細胞溶質(zhì)蛋白，是一種新型的促凋亡因子，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ER)中的未折疊蛋白反應(unfolded protein reaction，UPR)[6-7].最近的一些報道還表明CHAC1消耗細胞中的谷胱甘肽(GSH)，且在此過程中具有γ-谷氨?；h(huán)轉(zhuǎn)移酶活性[8-9].谷胱甘肽作為抗氧化劑調(diào)節(jié)細胞中的氧化平衡，而CHAC1蛋白的過表達使細胞內(nèi)的谷胱甘肽過度消耗，進而使細胞內(nèi)活性氧過度積累，從而促進細胞的死亡.然而，CHAC1在青蒿素引起的彌散性大B細胞淋巴瘤細胞中的作用機制仍不清楚，有待進一步了解.

青蒿素的抗腫瘤作用是目前研究的一個熱點，為了進一步探究青蒿素誘導的彌散性大 B 細胞淋巴瘤細胞增殖抑制過程中CHAC1基因作用及相關機理，我們通過慢病毒轉(zhuǎn)染的手法，獲得了沉默CHAC1基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，并利用沉默CHAC1基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，初步探討了CHAC1基因在青蒿素抑制彌散性大B細胞淋巴瘤細胞增殖中的作用，為青蒿素引起的彌散性大 B 細胞淋巴瘤的增殖抑制作用機理及難治型DLBCL新藥的開發(fā)提供了新的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗所用的細胞株

SU-DHL-8(人B細胞淋巴瘤細胞)來源于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司.

1.2 試劑、藥品

1640培養(yǎng)基、胎牛血清、谷氨酰胺購自以色列Biological industries公司；MTT粉末購自美侖生物公司；30%丙烯酰胺溶液、1.5 mol/L Tris(PH 8.8)、1.5 mol/L Tris(pH 6.8)、甘氨酸均購自生工生物有限公司；TEMED購自上海BBI 生命科學有限公司；化學發(fā)光檢測試劑盒購自Millipore生物公司；青蒿素購自上海阿達瑪斯試劑有限公司；CHAC1兔源一抗(ab76386)購自abcam生物公司；HRP標記的二抗購自上海BBI 生命科學有限公司；瞬時轉(zhuǎn)染的siRNA及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的shRNA均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；RIPA裂解液、嘌呤霉素鹽酸鹽購自上海翊圣生物科技有限公司；UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒購自生工生物有限公司；Hifair Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Super MiX for qPCR、2×Hieff PCR Master Mix(With Dye) 、Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus) 試劑盒均購自上海翊圣生物科技有限公司；其余試劑均為分析純.

1.3 儀器

imark型酶標儀(伯樂，美國)；DMi8型倒置熒光顯微鏡(徠卡，德國)； Quant Studio 5型實時定量PCR儀(賽默飛世爾，美國)；Eppendrof 5424R型低溫高速離心機(艾本德，德國)；1658001型垂直電泳帶轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(伯樂，美國)； Tanon 5200型化學發(fā)光成像儀(天能，中國上海)； Thermo Scientific 3425型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾，美國).

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)

本實驗所采用的人彌散性大B細胞淋巴瘤細胞SU-DHL-8為懸浮細胞，按照購買說明所述，細胞使用10%含牛胎血清1 640培養(yǎng)基，在37 ℃， 5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).

1.4.2 青蒿素對彌散性大B細胞淋巴瘤細胞增殖的抑制活性分析

收集對數(shù)增長期的SU-DHL-8細胞，離心，計數(shù)，接種于96孔板，并將已經(jīng)配制好的青蒿素儲備液(10 mol/L)分別稀釋到5個不同的濃度(100、20、4、0.8、0.16 μmol/L)，分別將不同濃度的藥物依次加入96孔板中，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h之后，每孔加入5 mg / mL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，吸出板內(nèi)的細胞液，加入100 μL DMSO溶解甲瓚，用普通酶標儀于570 nm處測定OD值，并計算抑制率.

1.4.3 qPCR測定基因的表達情況

將處于對數(shù)生長期的細胞收集離心、重懸計數(shù)，并將其接種于不同的細胞培養(yǎng)皿中，細胞密度為5×106個/皿，分別分為實驗組和對照組，兩組同時做時間梯度(2、24 h)，實驗組加入青蒿素，終濃度為10 μmol/L，對照組加入相同體積的DMSO，按時間梯度收集細胞，提取RNA，再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過擴增，qPCR等操作分析相關基因的表達情況.

1.4.4 Western blot檢測CHAC1蛋白的表達

將處于對數(shù)生長期的細胞收集計數(shù)，并接種于6孔板內(nèi)，細胞密度為5×105個/孔，實驗組分別加入不同濃度的樣品處理24 h，對照組加入相同體積的DMSO,收集細胞加入裂解液冰上裂解40 min，10 000 g，4 ℃離心10 min，取上清測定并調(diào)節(jié)蛋白濃度，使蛋白濃度相等，再將蛋白加入上樣緩沖液95 ℃變性5 min，離心，取上清上樣，樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，分離膠濕法轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，用含5%的脫脂奶粉TBST溶液封閉2 h，4 ℃敷一抗過夜，洗膜30 min，10 min/次;二抗1 h，洗膜30 min，10 min/次，將顯影液覆蓋洗好的膜避光孵育5 min，除去顯影液，用保鮮膜把膜包好，放入化學發(fā)光儀中顯影.

1.4.5 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染細胞模型的構建

1) siRNA片段的設計 根據(jù)要求設計合成的沉默CHAC1基因和SiRNA共有3個，編號及序列如表1所示.

表1 siRNA的相關信息

2) siRNA轉(zhuǎn)染步驟 收集對數(shù)生長期的細胞并接種于6孔板內(nèi)，細胞密度為(2～5)×106個/孔，取1 μL/孔lipofectamine 2 000(使用前輕輕搖勻)，用200 μL Opti-MEM稀釋，輕輕混合后，室溫孵育5 min，取2 μL 熒光標記的FAM siRNA或目標siRNA用200 μL Opti-MEM稀釋，輕輕混合均勻，室溫孵育20 min，將混合好的轉(zhuǎn)染物加入6孔板內(nèi)，400 μL/孔，(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)24 h，取適量熒光標記的FAM siRNA轉(zhuǎn)染的細胞于熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染效率.

1.4.6 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞模型的構建

1)shRNA的相關信息 CHAC1的核苷酸序列為5′-GATCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGA ACGT-GACACGTTCGGAGAACTTTTTTG-3′；Control為慢病毒干擾空載體LV3(H1/GFP & Puro).

2) shRNA的轉(zhuǎn)染步驟 收集對數(shù)生長期的細胞，計數(shù)并接種于96孔板(方法參照MTT實驗)，用無菌EP管稀釋1×108TU/mL的病毒原液分別為1，10、100倍；并將其分別加入孔板中，每孔10 μL(病毒終濃度相當于分別稀釋10、100、1 000倍)；37 ℃，5% CO2孵育8～12 h后觀察細胞形態(tài)(無明顯差異)，分別在感染24、48、72、96 h后觀察熒光表達情況，確定合適轉(zhuǎn)染濃度.將配置好的嘌呤霉素鹽酸鹽的儲備液(8 mg/mL)分別稀釋至0.5、1、2、4、8 μg/mL的工作液并加入96孔板中培養(yǎng)24 h，分別對每個質(zhì)量濃度梯度的細胞進行計數(shù)，確定嘌呤霉素鹽酸鹽的最小使用度量濃度(2 μg/mL)，對慢病毒轉(zhuǎn)染的細胞進行培養(yǎng)、傳代，每傳一代向細胞培養(yǎng)皿中加入嘌呤霉素鹽酸鹽，使每皿的終質(zhì)量濃度為2 μg/mL，這樣就得到了逐代富集的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，需要注意的是，實驗過程中的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株不需要再加入嘌呤霉素鹽酸鹽，以免影響實驗效果.

1.5 統(tǒng)計方法說明

文中數(shù)據(jù)平均值通過至少3次獨立實驗結果計算而得，誤差線用標準誤差(±SE)表示，統(tǒng)計學比較采用雙尾t檢驗，統(tǒng)計學顯著性數(shù)據(jù)用星號表示，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001.

2 結果與分析

2.1 青蒿素對彌散性大B細胞淋巴瘤的增殖抑制作用

MTT法測定細胞活性的結果如圖1a所示，青蒿素對彌散性大B細胞淋巴瘤細胞SU-DHL-8增殖有明顯的抑制效果，青蒿素的結構如圖1b.分別取不同用藥濃度的細胞用熒光顯微鏡觀察明場下細胞的密度并拍照如圖1c，與不加藥組相比，細胞的增殖受到明顯的抑制且具有濃度依賴性，和活性的測定結果一致.

2.2 青蒿素對CHAC1基因和蛋白的表達影響

采用qPCR的方法分析實驗組和對照組的CHAC1基因表達影響，結果如圖2a所示，與對照組相比實驗組中CHAC1基因的表達在2 h的時候無明顯區(qū)別，但在24 h的時候，實驗組中CHAC1基因的表達明顯上調(diào).采用Western Blot蛋白免疫印跡的方法分析青蒿素作用于彌散性大B細胞淋巴瘤細胞SU-DHL-8后CHAC1蛋白的表達情況如圖2b所示，在青蒿素刺激細胞24 h后，與對照組相比，實驗組中CHAC1蛋白的表達明顯提高.

qPCR基因表達值至少3次獨立實驗結果計算而得，誤差線用標準誤差(±SE)表示，統(tǒng)計學比較采用雙尾t檢驗，統(tǒng)計學顯著性數(shù)據(jù)用星號表示，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001.

2.3 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染細胞株的構建

siRNA感染細胞株之后轉(zhuǎn)染效率如圖3a所示，用熒光倒置顯微鏡分別在明場及熒光488 nm處拍攝，(熒光強度越強轉(zhuǎn)染效率越高)3個siRNA的轉(zhuǎn)染效率均>70%，對轉(zhuǎn)染的細胞進行基因表達分析如圖3b，與對照組相比(轉(zhuǎn)入FAM siRNA)，轉(zhuǎn)入沉默CHAC1的siRNA后，CHAC1基因的表達明顯下調(diào)；Western Blot實驗測定CHAC1蛋白的表達情況如圖3c，CHAC1蛋白表達減少；采用MTT實驗測定青蒿素對轉(zhuǎn)染后細胞株的增殖抑制結果如圖3d，與轉(zhuǎn)入FAM siRNA的細胞相比，青蒿素對轉(zhuǎn)入沉默CHAC1的siRNA細胞的增值抑制作用下降.這表明青蒿素對彌散性大B細胞淋巴瘤細胞SU-DHL-8的增殖抑制作用和CHAC1基因的表達相關.平均值通過至少3次獨立實驗結果計算而得，誤差線用標準誤差(±SE)表示，統(tǒng)計學比較采用雙尾t檢驗，統(tǒng)計學顯著性數(shù)據(jù)用星號表示，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001.

2.4 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞模型的構建

shRNA感染細胞后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率如圖4a，用熒光倒置顯微鏡分別在明場及熒光488 nm處拍攝，(熒光強度越強轉(zhuǎn)染效率越高)Control組和shRNA：CHAC1組的轉(zhuǎn)染均效率 > 90%.對轉(zhuǎn)染的細胞進行基因表達分析如圖4b，與Control組相比，轉(zhuǎn)入沉默CHAC1的shRNA后，CHAC1基因的表達明顯下調(diào)；Western Blot實驗測定CHAC1蛋白的表達情況如圖4c，沉默CHAC1基因后CHAC1蛋白的表達減少；采用MTT實驗測定青蒿素對轉(zhuǎn)染后細胞株的增殖抑制結果如圖4d，與Control組的細胞相比，青蒿素對轉(zhuǎn)入沉默CHAC1的shRNA細胞的增值抑制作用下降.這表明青蒿素對彌散性大B細胞淋巴瘤細胞SU-DHL-8的增殖抑制作用和CHAC1基因的表達相關.平均值通過至少3次獨立實驗結果計算而得，誤差線用標準誤差(±SE)表示，統(tǒng)計學比較采用雙尾t檢驗，統(tǒng)計學顯著性數(shù)據(jù)用星號表示，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001.

采用2種不同形式的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染后，siRNA及shRNA的轉(zhuǎn)染效率均>70%，視為有效轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染后的細胞分別進行基因表達分析及蛋白表達水平檢測，結果均顯示轉(zhuǎn)染沉默CHAC1基因的RNA片段后，SU-DHL-8細胞內(nèi)CHAC1基因及蛋白的表達均下降， MTT實驗對轉(zhuǎn)染的細胞株進行活性分析，結果表明選擇性沉默CHAC1基因后青蒿素對彌散性大B細胞淋巴瘤SU-DHL-8細胞的增值抑制作用下降.

3 討論

MTT實驗結果中，青蒿素對彌散性大B細胞淋巴瘤細胞SU-DHL-8有明顯的增殖抑制效果，進一步的基因及蛋白表達分析表明，在對彌散性大B細胞淋巴瘤細胞SU-DHL-8的增殖抑制過程中，青蒿素上調(diào)了CHAC1基因及蛋白的表達.這些結果說明CHAC1基因可能參與到青蒿素對彌散性大B細胞淋巴瘤增值抑制的作用機理中.

接著，我們采用沉默CHAC1基因的siRNA對SU-DHL-8細胞進行轉(zhuǎn)染實驗，在驗證了轉(zhuǎn)染效率之后，對轉(zhuǎn)染后的細胞的基因表達進行分析，結果表明，與對照組相比，在沉默CHAC1基因之后，細胞內(nèi)的CHAC1基因表達下調(diào)；對轉(zhuǎn)染的細胞進行蛋白表達分析，與對照組相比，CHAC1基因沉默后，CHAC1蛋白的表達水平降低；這說明siRNA轉(zhuǎn)入細胞后確實達到了沉默CHAC1基因的效果；我們同樣對轉(zhuǎn)染后的細胞進行活性分析，MTT實驗結果表明，在沉默CHAC1基因后，青蒿素對淋巴瘤細胞的增長抑制作用降低.這個結果進一步驗證了之前的分析.

課題組接著設計了和siRNA瞬時轉(zhuǎn)染相同實驗的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實驗，采用攜帶穩(wěn)定沉默CHAC1基因的慢病毒感染SU-DHL-8細胞，基因和蛋白表達分析結果表明轉(zhuǎn)染達到了預期的沉默效果，活性分析結果表明沉默掉CHAC1基因后，青蒿素對細胞株的增長抑制作用降低.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實驗結果和瞬時轉(zhuǎn)染的結果一致.這說明CHAC1基因在青蒿素對彌散性大B細胞淋巴瘤細胞SU-DHL-8增殖抑制中扮演著重要的角色.

通過建立轉(zhuǎn)染細胞株的模型，對CHAC1基因在青蒿素引起的彌散性大B細胞淋巴瘤細胞SU-DHL-8的增殖抑制作用中的表達情況進行了初步分析，印證了之前實驗的結果，在以往的研究中，青蒿素在抑制腫瘤細胞增殖過程中CHAC1基因的作用未見報道，而課題組的研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素在對DLBCL細胞的增殖抑制中上調(diào)了CHAC1基因的表達，且沉默CHAC1基因后，青蒿素對DLBCL細胞的增殖抑制作用減弱，說明CHAC1基因在青蒿素抗腫瘤作用機理中有一定的作用，我們的發(fā)現(xiàn)對進一步研究CHAC1基因的作用及青蒿素對腫瘤細胞的抑制作用機理提供了新的思路和方法，和瞬時轉(zhuǎn)染相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染能長時間保存轉(zhuǎn)染細胞模型，有利于對作用機理的長時間研究.