王瀚墨，李智敏，王元忠，肖 丹,2

(1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 藥用植物研究所,云南 昆明 650223； 2. 云南良旺生物科技有限公司,云南 昆明 650106)

瑪咖(Maca，LepidiummeyeniiWalp.)，十字花科獨(dú)行菜屬植物，原產(chǎn)南美秘魯安第斯山區(qū)海拔 3 500～4 000 m的區(qū)域.它的貯藏根曾被秘魯當(dāng)?shù)厝擞糜跔I養(yǎng)補(bǔ)充、加強(qiáng)體質(zhì)和提高生育能力等，甚至在當(dāng)?shù)爻蔀榈葍r(jià)交換的中介物[1].現(xiàn)代研究表明，瑪咖中的瑪咖烯、瑪咖酰胺、芥子油苷以及固醇等活性成分具有改善記憶障礙[2]、改善更年期婦女心理癥狀和性功能障礙[3]、改善性能力[4]、增加骨密度[5]、提高精子生成數(shù)量[6]、減少前列腺增生[7]、抗氧化、修復(fù)紫外線傷害皮膚[8]、抗疲勞等功能[9].同時(shí)瑪咖富含蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、微量元素等多種人體必需營養(yǎng)成分.2002年瑪咖僅在美國和日本銷量就達(dá)到20億美元，同年瑪咖被引入中國云南、新疆等地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性種植.2011年我國衛(wèi)生部正式批準(zhǔn)瑪咖粉作為新資源食品.

目前云南已建成全國最大的瑪咖規(guī)?；N及種植基地，推廣栽培已達(dá)10萬畝，產(chǎn)量占據(jù)全國的95%以上.麗江、中甸、昭通以及怒江、昆明的部分地區(qū)均有種植，但品質(zhì)略有參差.為使瑪咖的鑒別及質(zhì)量得到有效控制.本文采用氯仿快速提取法，并用三組平均值、四點(diǎn)平滑、一次微分等方法校準(zhǔn)和排除干擾，利用共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)系列法分析云南地區(qū)不同產(chǎn)區(qū)瑪咖紫外指紋圖譜相似性.結(jié)果表明，該方法具有穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好等特征，為快速、準(zhǔn)確鑒別云南不同產(chǎn)區(qū)瑪咖，品質(zhì)評(píng)價(jià)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

其中前10份瑪咖樣品采集于云南省瑪咖各主要種植區(qū)，所有瑪咖樣品均選擇各地瑪咖平均大小的個(gè)體并將其混合磨粉.P號(hào)樣品購自秘魯，見表1.

1.2 主要儀器與試劑

UV-2550雙通道紫外可見分光光度計(jì)(島津公司，配有UV probe工作站)；SY3200-T型超聲波清洗機(jī)(上海聲源超聲儀器設(shè)備有限公司)；AR1140型萬分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；FW-100型高速粉碎機(jī)(天津市華鑫儀器廠)；九陽JYL-C012多功能料理機(jī)(九陽股份有限公司)；0.301 mm標(biāo)準(zhǔn)篩盤(浙江上虞市道墟五四儀器廠)；130 mm陶瓷研缽.

表1 樣品來源

石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、95%乙醇(均為AR)；濃鹽酸、氫氧化鈉(均為CP)；二次蒸餾水.

1.3 紫外光譜測試樣品制備及測定條件

樣品50 ℃烘干，粉碎，研細(xì)使其全部通過0.301 mm標(biāo)準(zhǔn)篩，保存于自封袋內(nèi)備用.準(zhǔn)確稱取1.500 g樣品于25 mL比色管中，加入20 mL提取溶劑，室溫超聲提取40 min，經(jīng)3層濾紙獲得待測試樣品.以所選溶劑作為參比液，設(shè)定掃描波長為200～600 nm，重復(fù)3次，狹縫1.0 nm，采樣間隔0.2 nm進(jìn)行紫外光譜測定.

1.4 紫外光譜處理

所測瑪咖紫外原始光譜依次進(jìn)行3組平均，4點(diǎn)平滑，1次微分處理，以濾除光譜噪音，校準(zhǔn)基線，提高圖譜分辨率和測定準(zhǔn)確度[10].

2 方法與結(jié)果

2.1 最佳提取溶劑和提取時(shí)間

以秘魯產(chǎn)瑪咖P號(hào)樣品為對(duì)象，分別使用石油醚、石油醚與氯仿混合液(V∶V=1∶1)，氯仿、氯仿與乙酸乙酯混合液(V∶V=1∶1)、乙酸乙酯、甲醇、95%乙醇和雙蒸水作為溶劑，料液比0.020、0.025、0.030、0.040、0.050、0.075、0.100、0.200、0.300 g/mL，超聲時(shí)間0、10、20、30、40、50、60 min交叉進(jìn)行紫外測定，以1.3節(jié)方法測定3次，并以1.4節(jié)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理.篩選溶液實(shí)驗(yàn)紫外光譜結(jié)果見圖1.

結(jié)果表明，氯仿作為提取溶劑，料液比0.075 g/mL，超聲時(shí)間40 min提取瑪咖紫外吸收峰數(shù)明顯多于或等于其它溶劑、料液比和超聲時(shí)間提取的吸收峰數(shù).

2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取一份保存在0～5 ℃的樣品3提取液，分別在2、4、6、8、10 h時(shí)進(jìn)行紫外光譜測定，光譜數(shù)據(jù)經(jīng)1.4處理后8 h以吸收波長計(jì)算的RSD%在0.06%～2.33%之間.結(jié)果表明，該方法在8 h內(nèi)樣品保持穩(wěn)定.

2.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

以樣品3為考察對(duì)象，稱取0.100 0 g樣品5份，以氯仿為溶劑1.3法制取測試液并進(jìn)行紫外光譜掃描，光譜數(shù)據(jù)經(jīng)1.4處理后以吸收波長計(jì)算平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%在0.09%～1.81%之間，表明該方法重現(xiàn)性好.

2.4 云南地區(qū)不同產(chǎn)區(qū)瑪咖紫外指紋圖譜

通過2.1～2.3節(jié)實(shí)驗(yàn)，本研究最終選用超聲40 min，料液比0.075 g/mL的瑪咖氯仿提取液作為紫外光譜檢測的制備液.云南地區(qū)不同產(chǎn)區(qū)瑪咖紫外指紋圖譜見圖2.

2.5 紫外指紋圖譜共有峰和變異峰的確定

本研究采用W正態(tài)分布檢驗(yàn)不同紫外光譜中的共有峰.對(duì)于不符合正態(tài)分布，又十分接近的一組吸收峰，則采用組內(nèi)各吸收峰波長的極差值與本組及相鄰組之間的平均波數(shù)差值進(jìn)行比較，當(dāng)極差值顯著小于平均波數(shù)值時(shí)視為一組共有峰，反之視為變異峰[10].瑪咖紫外指紋圖譜吸收峰波長數(shù)據(jù)及共有峰的識(shí)別，見表2.

序號(hào)吸收峰波長λ/nm1238.60 219.40 207.60 203.60 2276.00238.20 220.80 216.20 213.20 210.80 204.20 202.40 3211.60 208.80 4275.40241.00 213.60 208.80 206.80 200.20 5275.20241.80 217.80 206.80 204.40 200.60 6303.20240.00 224.60 217.40 211.40 206.80 204.20 7225.40 221.60 216.20 211.00 204.60 8223.60 216.80 212.60 210.00 207.00 9279.00241.80 227.00 225.40 221.00 214.80 209.60 206.60 10259.40229.40 226.00 220.40 214.20 210.40 208.20 P276.80275.00222.80 217.80 212.80 210.40 207.60

注：在表中屬于同一列的吸收峰為共有峰.

不同產(chǎn)區(qū)瑪咖紫外指紋圖譜雙指標(biāo)序列分析結(jié)果計(jì)算紫外指紋圖譜共有峰率和變異峰率使用公式如下[11]：

共有峰率P=Ng/Nd×100%,

(1)

變異峰率Pva=na/Ng×100%,

(2)

Pvb=nb/Ng×100%,

(3)

其中：Ng代表2個(gè)圖譜中共有峰數(shù)，Nd代表獨(dú)立峰數(shù)(Nd=Ng+na+nb)，Pva代表a圖譜的變異峰率，na代表a圖譜的變異峰數(shù)，Pvb代表b圖譜的變異峰率，nb代表b圖譜的變異峰數(shù).

對(duì)云南地區(qū)不同產(chǎn)區(qū)瑪咖紫外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析結(jié)果如表3.

表3 樣品間的共有峰和變異峰率

續(xù)表3

序列P;Pva,Pvb(%)序列P;Pva,Pvb(%)序列P;Pva,Pvb(%)4∶940;50,1005∶P30;100,133.36∶P40;75,754∶837.5;100,66.75∶927.3;100,166.76∶137.5;133.3,33.34∶333.3;200,05∶125;200,1006∶236.4;75,1004∶630;100,133.35∶722.2;200,1506∶430;133.3,1004∶125;200,1005∶822.2;200,1506∶530;133.3,1004∶710;500,4005∶314.3;500,1006∶312.5;600,1007∶650;25,758∶1071.4;0,409∶666.7;33.3,16.77∶244.4;80,508∶962.5;0,609∶1066.7;33.3,16.77∶944.4;25,1008∶650;25,759∶P66.7;33.3,16.77∶842.9;66.7,66.78∶P50;25,759∶862.5;60,07∶1033.3;66.7,133.38∶742.9;66.7,66.79∶245.5;166.7,166.77∶P33.3;66.7,133.38∶340;150,09∶744.4;100,257∶128.6;150,1008∶437.5;66.7,1009∶440;100,507∶522.2;150,2008∶230;66.7,166.79∶133.3;166.7,33.37∶316.7;400,1008∶522.2;150,2009∶527.3;166.7,1007∶410;400,5008∶112.5;400,3009∶325;300,010∶871.4;40,0P∶966.7;16.7,33.310∶966.7;16.7,33.3P∶1055.6;40,4010∶462.5;40,20P∶250;250,166.710∶655.6;40,40P∶850;75,2510∶P55.6;40,40P∶444.4;75,5010∶250;250,166.7P∶640;75,7510∶733.3;133.3,66.7P∶733.3;133.3,66.710∶530;133.3,100P∶530;133.3,10010∶328.6;250,0P∶328.6;250,010∶122.2,250,50P∶122.2,250,50

注：*1∶6 37.5；33.3，133.3，這一數(shù)據(jù)表明：以1號(hào)樣品吸收峰為對(duì)照，用6號(hào)樣品吸收峰進(jìn)行比較；比較結(jié)果顯示：1號(hào)樣品與6號(hào)樣品吸收峰的共有峰率為37.5%，1號(hào)樣品吸收峰的相對(duì)變異峰率為33.3%，6號(hào)樣品吸收峰的相對(duì)變異峰率為133.3%.從共有峰率和變異峰率綜合看，二者之間相似性較小，差異性較高.

表3結(jié)果表明，云南不同產(chǎn)區(qū)的瑪咖存在一定的差異，這種差異可以通過紫外指紋圖譜的樣品間的變異峰進(jìn)行區(qū)分，而這種差異與產(chǎn)區(qū)間空間距離無關(guān).同一地域產(chǎn)區(qū)瑪咖的紫外指紋圖譜比較，仍存在相似性較小，而差異性則較高的情況，如：香格里拉建塘與香格里拉小中甸樣品間比較(1∶2,33.3%，33.3%，166.7%)，昭通昭陽區(qū)與昭通大山包樣品間比較(3∶10,28.6%，0%，250%)，昆明東川與祿勸轎子雪山樣品間比較(4∶9,40%，50%，100%)，會(huì)澤大海鄉(xiāng)與會(huì)澤烏蒙山樣品間比較(5∶8,22.2%，200%，150%)，麗江巨甸與麗江云嶺樣品間比較(6∶7，50%，75%，25%).而如9號(hào)祿勸轎子雪山樣品(9∶P,66.7%)、10號(hào)昭通大山包樣品(10∶P，55.6%)、8號(hào)會(huì)澤烏蒙山樣品(8∶P,50%)和2號(hào)香格里拉小中甸樣品(2∶P，50%)的吸收峰與秘魯?shù)腜號(hào)樣品的吸收峰較為相似，但仍具有一定的差異性.

3 結(jié)語

在紫外條件下利用雙指標(biāo)序列法，通過3組平均，4點(diǎn)平滑，1次微分處理建立了云南產(chǎn)瑪咖紫外指紋圖譜.該方法精密度高、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好，能準(zhǔn)確定性反映任意2個(gè)樣品之間的相似和差異情況，同時(shí)能從整體上對(duì)其進(jìn)行分組，與常用的模糊聚類相比更為客觀、直接，為農(nóng)產(chǎn)品定性評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ).

紫外指紋圖譜顯示，云南不同產(chǎn)區(qū)瑪咖樣品間最大共有峰率達(dá)75%，最小共有峰率為0%，變異峰率最大為∞，最小為0%.瑪咖樣品紫外指紋圖譜可以有效的區(qū)分云南地區(qū)不同產(chǎn)區(qū)的瑪咖樣品.不同樣品間紫外指紋圖譜相似性程度與其產(chǎn)區(qū)間的距離無關(guān)，這可能與云南地區(qū)種植瑪咖時(shí)間短，瑪咖種源來源復(fù)雜以及云南地區(qū)小區(qū)域地理、氣候多元性有關(guān).以樣品紫外吸收峰的共有峰率和變異峰率作為標(biāo)志，祿勸轎子雪山樣品、昭通大山包樣品、會(huì)澤烏蒙山樣品和香格里拉小中甸樣品與秘魯產(chǎn)的瑪咖成分更為接近，但仍具有一定的可識(shí)別的差異性.以上數(shù)據(jù)將為云南地區(qū)瑪咖的產(chǎn)區(qū)鑒別，以及種源篩選和種植區(qū)域選擇提供一定的理論依據(jù).