楊春菊，莊 敏，賴 奇，尹俊林，樊保敏，卞兆祥,2，林成源，曾廣智

(1.云南民族大學 云南民族大學-香港浸會大學傳統(tǒng)天然藥物研發(fā)聯(lián)合實驗室,云南 昆明 650500； 2. 香港浸會大學 中醫(yī)藥學院，香港)

Spexin(SPX)，又名神經(jīng)肽Q，是通過現(xiàn)代生物信息學技術發(fā)現(xiàn)并鑒定的神經(jīng)肽[1-2].成熟的spexin由14個氨基酸組成[3]，在脊椎動物中高度保守，并且廣泛表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化道上皮及內(nèi)分泌細胞中[4].研究證實，spexin屬于甘丙肽(galanin)家族，可有效激活甘丙肽受體2(GALR2)和甘丙肽受體3(GALR3)[5].組織分布結(jié)果顯示，GALR 2/3廣泛表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中，表明spexin可能具有多種生物學功能.

總的來說，spexin通過擔當體循環(huán)中的內(nèi)分泌信號和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)的方式來發(fā)揮它的生物學功能[6].現(xiàn)已研究報道的功能主要有以下幾方面：①促進胃腸道運動[1, 7]；②抑制動物的攝食[7-12]；③影響脂類代謝、血糖水平和能量平衡[13-19]；④鎮(zhèn)痛作用[5-20]；⑤對內(nèi)分泌組織的影響[3, 21-22]；⑥心血管和腎臟功能[20-23]；⑦抗抑郁和焦慮[24-25].盡管目前對spexin的研究不斷增多，也發(fā)現(xiàn)了其越來越多的功能，但這只是個開始，從現(xiàn)有的成果來看，它與物質(zhì)代謝、機體內(nèi)分泌和神經(jīng)中樞都有著千絲萬縷的聯(lián)系，值得我們進一步深入去探索它更多的功能，并闡明其中機制，最終服務于各種疾病的治療.為此，課題組構(gòu)建了spexin轉(zhuǎn)基因模型小鼠，并成功實現(xiàn)了穩(wěn)定繁育.這將為探索spexin更多的功能和相關機制提供更好的動物模型.同時開展了以spexin轉(zhuǎn)基因小鼠為對象的糖耐受實驗，以對該模型小鼠進行初步的表型分析，同時尋求它在葡萄糖代謝方面更多的證據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Tris 、EDTA購自美倫生物技術有限公司；DNA Marker購自Thermo Scientific公司；Taq DNA Polymerase 試劑盒購自Takara Biomedical Technology公司；Proteinase K購自Merk公司；瓊脂糖(Biowest)購自上海貝晶生物技術有限公司；核酸染料GelRed購自Biotium公司.PCR引物由上海生物工程有限公司合成；spexin ELISA試劑盒購自Phoenix Pharmaceuticals；葡萄糖購自Sigma；高脂飼料購自美國Research Diets；普通飼料和玉米芯墊料均購自四川省醫(yī)學科學院四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所.

1.2 儀器

Biosens SC Series-805全自動凝膠成像系統(tǒng)(中國上海)；Eppendrof 5424R低溫高速離心機(德國)；Analytik Jena FlexCycler 2多功能PCR儀(德國)；IKA干浴器(德國)；一恒THZ-100B恒溫培養(yǎng)搖床(中國上海)；君意JY-SPCT型水平電泳槽(中國北京)；血糖儀(美國強生)；iMark 酶標儀(日本Bio-Rad).

1.3 轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建

Spexin轉(zhuǎn)基因小鼠由賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司轉(zhuǎn)基因動物中心構(gòu)建，背景為C57BL/6.構(gòu)建過程為：將利用piggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子構(gòu)建的spexin過表達載體pPB[Exp]-CAG>mB230216G23Rik[NM_001242345.1], 用顯微注射技術注射到小鼠受精卵內(nèi)，再轉(zhuǎn)移到代孕母鼠內(nèi)自然生產(chǎn)，最后通過PCR法鑒定篩選子代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠.

1.4 小鼠的飼養(yǎng)和繁殖

小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房，溫度控制在21～23 ℃，濕度 50%～65% ，光照控制12 h明/12 h暗，所喂飼飼料、水及所用墊料、籠盒均經(jīng)過嚴格高壓滅菌，小鼠可自由采食和飲水，除在哺乳期的母鼠，每一籠內(nèi)小鼠不超過4只，墊料每周更換一次.小鼠繁殖時將同代性成熟的雌鼠和雄鼠按2∶1配對，并保證雌雄鼠基因型互異，每天觀察小鼠的狀態(tài)并及時添補食水，母鼠懷孕后立即單獨放入新的籠盒待產(chǎn).出生小鼠3周后斷奶并與母鼠分開喂養(yǎng)，用不銹鋼耳釘進行編號，并剪尾鑒定基因型.

1.5 小鼠的基因型鑒定

1.5.1 小鼠尾部組織基因組DNA的提取

在子鼠3周齡與母鼠分籠后，剪取2～3 mm尾部組織，置于1.5 mL Eppendorf管中，加入100 μL 消化緩沖液(50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris - HCl，0.1% Triton X - 100)和1 μL 蛋白酶K(終質(zhì)量濃度0.5 mg/mL)，56 ℃，190 r/min搖床過夜.然后98 ℃金屬浴13 min使蛋白酶K變性.最后室溫下14 000 r/min離心15 min，取1.5 μL上清液做PCR.

1.5.2 小鼠基因型的聚合酶鏈反應(PCR)

用G蛋白調(diào)節(jié)子7(Rgs7)做內(nèi)參，用了2對靶向spexin的引物來驗證.所用引物序列見表1.反應體系為25 μL，ddH2O 8.6 μL, 正反向的目的基因引物各0.8 μL，內(nèi)參各0.4 μL，預混聚合酶12.5 μL，模版1.5 μL.PCR擴增條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火35 s，72 ℃ 延伸35 s，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min；-20 ℃ 保存.

表1 PCR引物

注：Rgs7(G蛋白調(diào)節(jié)子7)為內(nèi)參.

1.5.3 瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖0.128 g 溶于16 mL 1×TBE中，微波加熱充分溶解后加入1.6 μL Gelred混勻，降溫至50～60 ℃，倒入插好梳子的膠床，冷卻30 min以上即可使用.DNA每孔加5 μL，電泳電壓120 V，時間35 min.電泳結(jié)束后用凝膠成像儀進行拍攝和分析.

1.6 小鼠血清spexin檢測

取小鼠全血80～100 μL，室溫靜置1～2 h，4 ℃，3 500 r/min 離心10 min，取上清50 μL，按Phoenix Pharmaceuticals spexin ELISA試劑盒方案測定其中所含spexin的濃度.

1.7 糖耐受實驗

隨機選取了10～14周齡的轉(zhuǎn)基因型雄鼠、野生型雄鼠各8只，于實驗前85 d飼喂高脂飼料，每天稱量小鼠體重，進行糖耐受實驗時平均體重達42 g.小鼠出生日期及連續(xù)飼喂高脂飼料85 d后的體重信息如表2所示.從第86天開始，開始糖耐受實驗，為減少組間差異，選體重相近的陰陽小鼠各一只組成一組，2只小鼠于實驗前一天同時禁食16 h，每天上午一組下午一組共4只進行糖耐受實驗，16只小鼠分4 d完成實驗.給藥方式采用灌胃按1 g/kg的劑量給葡萄糖，分別在0、15、30、60、90、120 min時從尾靜脈取血測定血糖濃度[26].

表2 糖耐受實驗小鼠信息

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)以Mean±SEM的形式表示，用Graphpad prism 7軟件進行Student’s t - test顯著性差異分析.p值小于 0.05 作為有顯著性差異，p值小于 0.01 作為有極顯著性差異.

2 結(jié)果

2.1 小鼠的基因型鑒定

所用引物共有3對，內(nèi)標引物擴增出的條帶為507 bp，靶向小鼠內(nèi)源性Rgs7基因，故野生型和轉(zhuǎn)基因型小鼠均在507 bp的位置有明亮的條帶.目標基因由兩對引物共同確證，野生型小鼠在301 bp(圖1b)、300 bp(圖1a)的位置均沒有條帶；而spexin轉(zhuǎn)基因型的小鼠在301 bp(圖1b)、300 bp的位置均能擴增出很亮的條帶(圖1a).說明轉(zhuǎn)基因型小鼠體內(nèi)spexin過表達的PB轉(zhuǎn)座子成功插入小鼠基因組中，且能穩(wěn)定遺傳.

子鼠出生3周后剪尾提取總DNA后進行PCR擴增，之后進行瓊脂糖凝膠電泳.PCR擴增時總共使用3對引物，圖1a是采用表1中spexin F2、spexin R2及內(nèi)參Rgs7 F 、Rgs7 R兩對引物，靶向spexin的引物可擴增出分子量為300 bp的片段，內(nèi)參擴增出的片段分子量為507 bp.電泳結(jié)果為轉(zhuǎn)基因型小鼠分別在300 bp和507 bp位置有很亮的條帶，野生型僅507 bp的位置有很亮的條帶；圖1b是采用表1中spexin F1、spexin R1及內(nèi)參Rgs7 F 、Rgs7 R兩對引物，靶向spexin的引物可擴增出分子量為301 bp的片段.電泳結(jié)果為僅轉(zhuǎn)基因型小鼠可在301 bp的位置出現(xiàn)很亮的條帶.所用DNA ladder分子量為100～1000 bp.

2.2 ELISA試劑盒測定血清中spexin濃度結(jié)果

我們隨機測定了轉(zhuǎn)基因型雌鼠、野生型雌鼠、轉(zhuǎn)基因型雄鼠、野生型雄鼠各10只血清中spexin的含量，結(jié)果如圖2所示，雌性轉(zhuǎn)基因型小鼠血清中spexin濃度為野生型小鼠的1.25倍，兩者之間具有極顯著性差異(P=0.009 4)，雄性轉(zhuǎn)基因型小鼠血清中spexin濃度為野生型小鼠的1.23倍，兩者之間也具有極顯著性差異(P=0.009 6)；而無論是野生型雌雄小鼠之間(P=0.5366)還是轉(zhuǎn)基因型雌雄小鼠之間(P=0.682 2)，它們血清中spexin的濃度均無顯著性差異.說明轉(zhuǎn)基因型小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)入的基因能穩(wěn)定高表達，spexin轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建成功且其血清中的含量沒有性別差異.

隨機抽取40只小鼠測定血清中spexin的濃度，圖2a是雌性轉(zhuǎn)基因型小鼠和野生型小鼠血清中spexin濃度具有極顯著性差異(轉(zhuǎn)基因型為野生型的1.25倍，P=0.009 4)；圖2b是雄性轉(zhuǎn)基因型小鼠和野生型小鼠血清中spexin濃度具有極顯著性差異(轉(zhuǎn)基因型為野生型的1.23倍，P=0.009 6)；圖2c是野生型小鼠雌性和雄性小鼠之間血清中spexin濃度沒有差異(P=0.536 6)；圖2d是轉(zhuǎn)基因型小鼠雌性和雄性小鼠之間血清中spexin濃度沒有差異(P=0.6822).結(jié)果表示為Mean±SEM(n=10/組)，Student’s t - test結(jié)果為**P< 0.01，ns(not significant，差異無統(tǒng)計學意義)P>0.05.

2.3 糖耐受實驗初步驗證轉(zhuǎn)基因小鼠表型

飼喂高脂飼料的85 d內(nèi)，每天稱量小鼠體重，小鼠平均體重由25.02 g增長至42.58 g，但是轉(zhuǎn)基因型小鼠和野生型小鼠之間體重增長無差異(圖3a)；糖耐受結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因型小鼠每個時間點的血糖濃度均低于野生型小鼠的，且在15 min時，兩者具有顯著性差異(P=0.018 2)(圖3b).說明在spexin轉(zhuǎn)基因小鼠模型體內(nèi)，spexin表達水平的升高在一定程度上提高了小鼠的糖耐受能力，但對脂代謝的影響不夠顯著.

隨機挑選10 ～ 14周齡的小鼠，轉(zhuǎn)基因型和野生型各8只，于糖耐受實驗前85 d開始飼喂高脂飼料，每天監(jiān)測體重變化.圖3a是飼喂高脂飼料85 d后，小鼠平均體重由25.02 g達到42.58 g，但轉(zhuǎn)基因型小鼠和野生型小鼠的體重變化沒有顯著性差異；圖3b是給小鼠禁食16 h后，采用灌胃的方式給小鼠1 g/kg的葡萄糖，分別在0、15、30、60、90、120 min時從尾靜脈取血測定血糖值.結(jié)果在每個時間點，轉(zhuǎn)基因型小鼠的血糖濃度均低于野生型小鼠的，且在15 min時，兩者具有顯著性差異(P=0.0182).結(jié)果表示為Mean ± SEM(n=8/組)，Student’s t - test結(jié)果為*P<0.05.

3 討論

Spexin作為一個新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)肽，在脊椎動物中高度保守且分布廣泛，意味著它可能具有多種生物學功能.從現(xiàn)有的研究成果看，它在胃腸道運動、動物攝食、脂類代謝、糖類代謝、鎮(zhèn)痛、內(nèi)分泌組織、心血管和腎臟、抑郁和焦慮等方面都有一定的功能，但其相關機制和信號傳導通路等尚待探索.且無論從spexin的組織分布還是從目前窺探到的功能來看，這個新型的神經(jīng)肽都值得更深入的研究，未來它或可為肥胖、糖尿病、抑郁、焦慮等尚困擾著我們?nèi)祟惖募膊〉闹委熖峁┬碌乃悸泛筒呗?

鑒于以上所述，課題組成功構(gòu)建了spexin轉(zhuǎn)基因小鼠，并成功實現(xiàn)了穩(wěn)定繁育.這將為開展更多關于spexin的研究提供很好的模式動物.我們構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠，從PCR結(jié)果上看，spexin過表達的PB轉(zhuǎn)座子已成功插入基因組，而從ELISA結(jié)果上看，該片段能穩(wěn)定表達出spexin.也就是說，無論從基因?qū)用孢€是蛋白層面，我們構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠都是成功的.而且通過對小鼠的繁育及生長狀態(tài)的監(jiān)測，該spexin轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型可穩(wěn)定遺傳，其外觀表型與野生型小鼠并無明顯差異.

目前已有不少研究發(fā)現(xiàn)spexin跟脂類和葡萄糖的代謝相關，有研究報道，在人體內(nèi)血液循環(huán)中spexin含量與代謝綜合征有關[27].隨機挑選了16只雄鼠(轉(zhuǎn)基因型和野生型各8只)于實驗前85 d飼喂高脂飼料，每天監(jiān)測體重變化，當平均體重達42.58 g時進行了糖耐受實驗.結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因型小鼠每個時間點的血糖濃度均低于野生型小鼠，且在15 min時具有顯著性差異.這從一定程度上反映出在小鼠體內(nèi)，spexin與葡萄糖的代謝有關聯(lián).此前已有研究報道，給高脂飼料誘導的肥胖小鼠注射spexin能改善小鼠糖耐受能力[17].實驗結(jié)果為此結(jié)論提供了更多的佐證.此外，亦有研究報道在II型糖尿病病人血液中spexin的水平相對健康人顯著降低，且與血液中葡萄糖的含量呈負相關[16].通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，成年健康女性血液中spexin的水平與血糖顯著負相關[15].但也有研究表明，spexin的水平在一定程度上影響了處于孕期中女性的血糖水平[28]，且與患有妊娠期糖尿病女性的血糖正相關[29].這些研究結(jié)果說明spexin與葡萄糖代謝具有相關性，但其具體功能及機制仍需進行深入研究.在飼喂高脂飼料85天內(nèi)，轉(zhuǎn)基因型小鼠和野生型小鼠的體重變化并沒有顯著性差異.之前有報道給野生型小鼠連續(xù)腹腔注射spexin 28 d，劑量為25 μg/kg時，能顯著抑制小鼠體重增長，測定血清中spexin濃度發(fā)現(xiàn)，該組小鼠血清中spexin濃度為對照組的1.86倍[19].而根據(jù)ELISA結(jié)果，構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因模型雄性小鼠血清中spexin濃度為野生型小鼠的1.23倍.此外還有小鼠的個體差異、所飼喂飼料差異、樣本容量大小，把這些因素綜合起來可能是轉(zhuǎn)基因型小鼠和野生型小鼠之間體重增長沒有顯著性差異的原因.

綜上所述，構(gòu)建的spexin轉(zhuǎn)基因小鼠模型，在基因?qū)用婧偷鞍讓用鎠pexin的含量都較野生型有顯著提高，且其糖耐受能力也有所增強.該模型的成功構(gòu)建，將為今后做關于spexin更系統(tǒng)、更深入的研究提供很好的模式動物.