張靖宇

(鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，鄭州 451100)

龍骨，來(lái)源于古代哺乳類(lèi)動(dòng)物的骨骼化石，如馬、牛類(lèi)、 鹿類(lèi)、象類(lèi)等。龍骨屬于礦物類(lèi)中藥, 主要分布在我國(guó)的西南部地區(qū),全株入藥。其主要功效有舒筋活絡(luò)和祛風(fēng)除濕，民間用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、胃痛病等[1]。骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是臨床中常見(jiàn)的疾病，骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，龍骨具有較強(qiáng)的促進(jìn)骨傷愈合的功能[2]。本文對(duì)中藥龍骨對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的氧化損傷是否具有可逆作用，是否具有促進(jìn)受損傷神經(jīng)組織功能修復(fù)的作用進(jìn)行研究，期望找到可能治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物，為骨關(guān)節(jié)炎治療提供藥物奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物材料

健康 6 月齡新西蘭大白兔30只，雌雄各半，空腹體重2.5kg左右。小鼠40只，雌雄各半，體重 20g左右。實(shí)驗(yàn)材料由上海生旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(SCXK-2008-0002)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的 《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的要求。

1.1.2 藥品與試劑

將中藥龍骨過(guò)100目篩、煎煮2h, 制成龍骨水煎劑。

主要化學(xué)試劑：活性氧檢測(cè)試劑盒、 NO檢測(cè)試劑盒、IL- 1β、TNF α 放免試劑盒、低熔點(diǎn)瓊脂、戊巴比妥鈉等。其他為分析純。

1.2 方法

1.2.1 小鼠抗軟骨細(xì)胞氧化損傷模型

將30只大白兔分為5組，分成對(duì)照組、模型組、添加龍骨水煎劑低劑量組、添加龍骨水煎劑中劑量組、添加龍骨水煎劑高劑量組，每組6只[3]。正常對(duì)照組由大白兔手術(shù)分離獲得，10%IMDM 培養(yǎng)液培養(yǎng)；骨關(guān)節(jié)炎模型組分 4 組，由動(dòng)物造模組獲得，模型組 10%IMDM 正常培養(yǎng)。添加龍骨水煎劑低劑量組10 μg/mL龍骨水煎劑，添加龍骨水煎劑中劑量組20 μg/mL龍骨水煎劑，添加龍骨水煎劑高劑量組40 μg/mL龍骨水煎劑。

兔骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的建立采用改良Hulth法[4]。主要是切斷內(nèi)側(cè)副韌帶、前后交叉韌帶、切除大白兔內(nèi)側(cè)半月板。將大白兔仰臥、四肢固定于手術(shù)臺(tái)上，脫毛，消毒，取雙后膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)橫向切口，打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，探查關(guān)節(jié)腔無(wú)原發(fā)病變后，切斷前交叉韌帶，全部切除內(nèi)側(cè)半月板造模，逐層縫合切口。對(duì)照組操作同前，但不切斷前交叉韌帶和切除內(nèi)側(cè)半月板。一籠一兔喂養(yǎng)，喂養(yǎng)期間對(duì)大白兔進(jìn)行訓(xùn)練，每天行走半小時(shí)。每周重復(fù)完成一組模型，共4周。第5周開(kāi)始，每周處死一組動(dòng)物，得到大白兔的軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)，測(cè)定數(shù)據(jù)，連續(xù)4周。

1.2.2 軟骨細(xì)胞提取與培養(yǎng)

將大白兔固定后，處死，截取膝關(guān)節(jié)，浸入無(wú)菌液體。截取關(guān)節(jié)表面軟骨，放入盛有D-Hank＇s無(wú)菌平皿中。后放入IMDM 培養(yǎng)液中，2000 r/min 離心 10min。收集離心后軟骨，加入胰蛋白酶，37℃消化30 min。離心收集沉淀放入4 mL 0.2%膠原酶中。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4 h。2000 r/min 離心 10min，收集沉淀，放入IMDM 培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中，置 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[5]。

1.2.3 軟骨細(xì)胞中活性氧(ROS)的測(cè)定

選擇DCFH-DA 法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。稀釋 DCFH -DA達(dá)到1∶ 1 000倍，終濃度是10μm。細(xì)胞液放入DCFH-DA稀釋液中。細(xì)胞濃度在15×106/mL。每隔一段時(shí)間搖晃一次。30min后用無(wú)血清培養(yǎng)液，除去DCFH-DA稀釋液。流式細(xì)胞儀488nm光激發(fā)，525nm檢測(cè)發(fā)射光強(qiáng)度，計(jì)數(shù)1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度反應(yīng)活性氧水平[6]。

1.2.4 NO、SOD 和 GSH-Px 含量的測(cè)定

將軟骨細(xì)胞接種在24孔板中，每隔孔板0.5mL，重復(fù)6組。培養(yǎng)72小時(shí)后，細(xì)胞貼壁，用龍骨水煎液培養(yǎng)48h，收集上清液，5 000 r/min離心 10 min，取上清液凍存。

NO檢測(cè)：采用Griess 法，以NaNO2為標(biāo)準(zhǔn)品，0，1，2，5，10，20，60 μm濃度不同繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品，計(jì)算樣品中亞硝酸鹽的濃度，就是溶液中 NO濃度[7]。

SOD采用黃嘌呤氧化酶法。用可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度，當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD 時(shí),對(duì)超氧陰離子自由基有專(zhuān)一的抑制作用, 減少亞硝酸鹽的形成,通過(guò)公式計(jì)算可求出被測(cè)樣品中的SOD 活力[8]。

GSH-Px 含量采用DTNB法測(cè)定[9]。

1.2.5 抗坐骨神經(jīng)損傷測(cè)定

實(shí)驗(yàn)分成2個(gè)小組，連續(xù)給小鼠用藥4天。第5天麻醉小鼠，分離小鼠坐骨神經(jīng)，形成坐骨神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型。術(shù)后小鼠每天連續(xù)給灌服龍骨水煎劑, 持續(xù)2周。在術(shù)后第3周開(kāi)始將小鼠放置在鼠籠上，記錄小鼠爬網(wǎng)漏出鼠腳次數(shù)。每隔1周觀察一次，每次5分鐘[10]。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞中 ROS 測(cè)定

對(duì)照組ROS平均測(cè)定是6.67±0.12，模型組ROS平均測(cè)定是13.56±0.44。兩組相比較P值<0．001，說(shuō)明骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中存在氧化損傷情況。龍骨水煎劑低、中、高劑量組為10.54±0.31、9.14±0.72、7.89±0.91。模型組與龍骨水煎劑低、中、高劑量組相比較P值均<0．001，而且龍骨水煎劑低、中、高劑量組兩兩相比較顯著性小于0.001和0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入劑量不同的龍骨水煎劑后，存在降低骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中活性氧水平的情況，并且隨著龍骨水煎劑劑量的增加，骨關(guān)節(jié)炎抗氧化損傷作用增強(qiáng)，出現(xiàn)了一定劑量的依賴(lài)性情況。

2.2 軟骨細(xì)胞中 NO、SOD 和 GSH-Px 測(cè)定

表1 龍骨水煎劑對(duì)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清中 NO、SOD 和 GSH-Px的影響Tab.1 The effect of the keel water decoction on the cultivation of chondrocytes on the NO, SOD and GSH-Px

表1顯示，NaNO2檢測(cè)結(jié)果模型組與龍骨水煎劑低劑量組、中劑量組和高劑量組相比，都是P<0.01，極顯著。龍骨水煎劑三個(gè)組分兩兩比較，P>0.05，不顯著。正常對(duì)照組相比較下，從骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞培養(yǎng)情況看出，NO含量升高，說(shuō)明骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞上存在著氧化損傷情況。在龍骨水煎劑處理下骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的NO存在下降情況，說(shuō)明龍骨水煎劑能減輕細(xì)胞的氧化損傷。

表1顯示SOD 檢測(cè)結(jié)果，模型組與龍骨水煎劑低劑量組、中劑量組和高劑量組對(duì)比，P<0.05顯著。龍骨水煎劑三個(gè)組分兩兩比較，P>0.05，不顯著。GSH-Px 檢測(cè)結(jié)果，模型組與龍骨水煎劑低劑量組相比，P>0.05，不顯著。模型組與中劑量組和高劑量組相比，P<0.01，極顯著。龍骨水煎劑三個(gè)組分兩兩比較，P<0.05，顯著。正常對(duì)照組相比較下，骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞培養(yǎng)情況看出，SOD、GSH-Px 含量明顯降低，說(shuō)明細(xì)胞的抗氧化能力減弱。隨著龍骨水煎劑濃度的增加，SOD 和 GSH- Px 有升高趨勢(shì)，說(shuō)明細(xì)胞的抗氧化能力增強(qiáng)。龍骨水煎劑在一定范圍內(nèi)能提高軟骨細(xì)胞的抗氧化能力。

2.3 抗坐骨神經(jīng)損傷測(cè)定

表2 龍骨對(duì)小鼠坐骨神經(jīng)損傷后步態(tài)恢復(fù)的影響Tab.2 The effect of keel on gait recovery after sciatic nerve injury in mice %

由表2看出，隨著小鼠灌胃龍骨水煎劑后，小鼠漏腳率逐漸下降，且低于生理鹽水。在連續(xù)灌服龍骨水煎液后，小鼠坐骨神經(jīng)損傷后步態(tài)在第4、第5周時(shí)明顯減少，說(shuō)明龍骨水煎劑作用于小鼠坐骨神經(jīng)后，具有促進(jìn)受損傷神經(jīng)組織功能修復(fù)的作用。

3 結(jié)語(yǔ)

本文對(duì)大白兔的骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行NO 、SOD和GSH-Px 測(cè)定，確定含量的變化。對(duì)照組和模型組顯示，軟骨細(xì)胞中存在氧化損傷現(xiàn)象。加入龍骨水煎劑后，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的氧化損傷存在可逆現(xiàn)象，也就是說(shuō)有逆轉(zhuǎn)作用。隨著龍骨水煎劑濃度的增加，氧化損傷逐漸減小，說(shuō)明龍骨水煎劑能保護(hù)骨關(guān)節(jié)炎中的軟骨細(xì)胞。在對(duì)小鼠抗坐骨神經(jīng)損傷測(cè)定方面，在連續(xù)灌服龍骨水煎液后，小鼠坐骨神經(jīng)損傷后步態(tài)明顯減少，說(shuō)明龍骨水煎劑作用于小鼠坐骨神經(jīng)后，具有促進(jìn)受損傷神經(jīng)組織功能修復(fù)的作用。這一結(jié)果對(duì)治療和修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎有一定的作用，臨床應(yīng)用前景廣闊。