孔祥怡，杜建時(shí)，叢樂(lè)樂(lè)，趙 晴

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.血管外科；2.皮膚科；3.南湖院區(qū)神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130033)

阿爾茨海默病(AD)是癡呆綜合征最常見(jiàn)的一種，老年人多發(fā)，其特征在于不可逆的記憶喪失和認(rèn)知能力下降[1]，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶障礙、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙、人格和行為改變等，是60%-70%的老年癡呆癥的潛在原因[2]。阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，可能與遺傳、環(huán)境密切相關(guān)[3]，而基因的甲基化作為作為其發(fā)病機(jī)制的一個(gè)部分，在阿爾茨海默病的起病過(guò)程中起著不可忽視的作用[4,5]。OPRK1作為阿片類受體基因，在人類的記憶、學(xué)習(xí)過(guò)程發(fā)揮重要作用，該基因的甲基化依靠調(diào)控基因表達(dá)促使阿爾茨海默病發(fā)病。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討外周血中OPRK1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，為阿爾茨海默病患者的早期診斷及治療提供指導(dǎo)意見(jiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對(duì)象 所有病例均取自2015年10月-2017年12月吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院認(rèn)知功能障礙門(mén)診及神經(jīng)內(nèi)一科病房收入院的患者，AD組為老年阿爾茨海默病患者，同時(shí)選取我科門(mén)診就診患者既往無(wú)重大疾病，目前無(wú)急癥的非AD患者為對(duì)照組。研究對(duì)象共例AD組45例，對(duì)照組55例。此項(xiàng)目已在我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)立項(xiàng)，入組患者對(duì)項(xiàng)目知情并簽署知情同意書(shū)，兩組間基線資料對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：全部患者符合美國(guó)精神病學(xué)會(huì)的精神障礙診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第4修訂版(DSM-IV)中AD的診斷標(biāo)準(zhǔn)；排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他類型癡呆的患者，(2)患有嚴(yán)重原發(fā)性疾病患者，(3)有精神病史患者，有腦卒中、頭外傷患者。

1.1.2標(biāo)本收集 EDTA管留取患者清晨空腹血樣，3 000 g×10 min離心，小心吸取中間白細(xì)胞層，編號(hào)，-80℃保存樣本。

1.2 方法

應(yīng)用Wizard Genomic DNA Purification Kit試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA的提取。采用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit試劑盒，(購(gòu)于德國(guó)Qiagen公司)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA的亞硫酸氫鹽處理。以亞硫酸氫鹽處理后的DNA模板為樣本，利用甲基化及非甲基化引物通過(guò)PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增?？偡磻?yīng)體系25 μl，DNA模板1 μl，EpiTect Master Mix12.5 μl，RNase-free water 10.5 μl，甲基化及非甲基化引物各0.5 μl。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，94℃變性15 s，55℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃

保存，取5 μl PCR產(chǎn)物、1 μl Loading Buffer，通過(guò)綠如藍(lán)核酸染料進(jìn)行染色，在3.0%瓊脂糖凝膠中上樣，120V電泳，在全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)GelDocXR+下顯像。OPRK1基因以甲基化引物(M)出現(xiàn)產(chǎn)物條帶判斷為陽(yáng)性，非甲基化引物(U)出現(xiàn)產(chǎn)物條帶判斷為陰性，當(dāng)甲基化引物出現(xiàn)產(chǎn)物條和非甲基化引物同時(shí)出現(xiàn)產(chǎn)物條帶判斷為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 OPRK1基因甲基化結(jié)果

AD組OPRK1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率明顯高于對(duì)照組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者比較，χ2值=22.37，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 OPRK1基因甲基化結(jié)果

注：χ2=22.37；P<0.05.

2.2 MSP擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖

圖1.1示：AD組U出現(xiàn)產(chǎn)物條帶，部分M出現(xiàn)產(chǎn)物條帶；圖1.2為對(duì)照組，M及U均出現(xiàn)產(chǎn)物條帶，既存在甲基化改變，又存在非甲基化改變。

注：Marker:2000 bp DNA； U:unmethylation ； M:methylation

3 討論

脫氧核糖核酸甲基化是基因調(diào)控常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)之一，脫氧核糖核酸甲基化是將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶的一種反應(yīng)[6]。表觀遺傳修飾包含脫氧核糖核酸甲基化、組蛋白修飾和微小核糖核酸。甲基化能夠影響脫氧核糖核酸與蛋白質(zhì)相互作用方式，進(jìn)而改變基因的表達(dá)形式[7,8]，不同基因的甲基化可能從多方面影響癡呆的發(fā)生。

OPRK1基因編碼阿片受體，基因發(fā)生甲基化與阿爾茨海默病的發(fā)病可能有一定的關(guān)系，被認(rèn)為是治療神經(jīng)疾病的藥物靶點(diǎn)，在認(rèn)知障礙的發(fā)生過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[9]。阿片受體主要分布在海馬區(qū)域[10]，它利用神經(jīng)保護(hù)作用，減少β-淀粉樣蛋白的生成，影響阿爾茨海默病的發(fā)病[11,12]。隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，阿爾茨海默病的人群患病率逐年上升，阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制至今仍很不明確，早期的診斷尤為困難，給患者本人、家庭、社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)，所以對(duì)阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制探索，從分子生物學(xué)水平有大量的研究證明，阿爾茨海默病的發(fā)病與脫氧核糖核酸甲基化密切相關(guān)[13]。

脫氧核糖核酸的甲基化可能造成神經(jīng)退行性疾病發(fā)生，本次研究中，阿爾茨海默病組的基因甲基化率明顯高于健康對(duì)照組，OPRK1基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化改變阿爾茨海默病組的患者檢測(cè)出共有31(68.89%)例患者，而在健康對(duì)照組中只有12(21.82%)例患者發(fā)生改變，JiHuihui等人也作出了同樣的結(jié)果[14]。性別是阿爾茨海默病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)重要因素，有研究表明基因組甲基化在男、女之間有一定的區(qū)別[15]，本次研究顯示阿爾茨海默病OPRK1基因甲基化與男女性別無(wú)相關(guān)性，這個(gè)結(jié)果可能需要更多的實(shí)驗(yàn)研究闡明性別對(duì)表觀遺傳變化的影響，基于分子、細(xì)胞和小鼠動(dòng)物模型等多個(gè)層次系統(tǒng)的研究都取得了豐碩的成果[16]。

目前，隨著基因檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，與阿爾茨海默病發(fā)病相關(guān)的易感基因的甲基化狀態(tài)被逐漸被人類發(fā)現(xiàn)，可以在早期發(fā)現(xiàn)這些易感基因的改變，從而建立一個(gè)易感基因譜，為疾病的早期診斷、早期治療提高科學(xué)的依據(jù)。