国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

左旋精氨酸對eNOS在大鼠實驗性牙移動中表達影響的研究

2019-08-02 08:39李明賀
中國實驗診斷學(xué) 2019年7期
關(guān)鍵詞:實驗性牙周組織骨細胞

李 慧,李 佳,汪 洋,李明賀

(1.首都醫(yī)科大學(xué)密云教學(xué)醫(yī)院 口腔科,北京101500;2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 頜面外科,吉林 長春130041;3.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 正畸科,吉林 長春130041)

正畸的核心是牙移動[1],實現(xiàn)牙移動則需要通過牙周組織的改建,包括血管改建和骨改建,而牙齒移動速度和正畸矯治療程便取決于牙周組織的改建水平。對其機制的研究以及方法的實現(xiàn)對口腔正畸臨床工作具有重要的意義。對此諸多學(xué)者做了大量的研究,發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)慕o藥、加入細胞因子以及物理方法的使用等將會促進牙周組織改建,即對正畸臨床提供加速牙移動的方法,但仍處于探索階段。以往有研究表明,內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)參與正畸牙移動牙周組織改建[2]。本研究旨在通過建立大鼠實驗性牙移動模型,注射一氧化氮(nitric oxide,NO)前體左旋精氨酸(L-arginine,L-Arg),觀察eNOS在牙周組織中的表達,研究在實驗性牙移動牙周組織的血管改建和骨改建中eNOS和NO如何發(fā)揮作用,從而進一步闡釋實驗性牙移動牙周組織改建的機制,并為L-Arg的相關(guān)臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。目前對此尚未見有報道。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

取40只健康的6周齡雄性Wistar大鼠,體重為(0.15±0.02)kg,(由吉林大學(xué)動物實驗室提供)。隨機分為實驗組與對照組各20只,實驗組與對照組按文獻[3]描述建立實驗性牙移動動物模型(置NiTi螺簧于大鼠右上第一磨牙和上頜切牙之間,支抗牙為上頜切牙,拉右上頜第一磨牙以50 g的力,使其向近中移動),加力后立即對實驗組大鼠用L-Arg(300 mg/kg/d[4]在0.5 ml生理鹽水中溶解)行腹腔注射,對照組用等量的生理鹽水注射,1次/天。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗eNOS多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);免疫組織化學(xué)SP試劑盒(福州邁新公司);L-Arg(美國 Sigma 公司);XL-I型正畸測力計(西北工業(yè)大學(xué))。

1.3 標本制作

應(yīng)用經(jīng)1‰DEPCS水處理過的4%多聚甲醛在加力注射后的1、3、5、7、14天經(jīng)心臟灌注分別處死兩組動物各4只。制作牙周組織和牙的聯(lián)合標本,經(jīng)過固定過夜、脫鈣、脫水及石蠟包埋,制作5 μm厚的組織切片,其為近遠中方向、以右上頜第一磨牙為中心。常規(guī)HE染色作組織的定位參照片,以代替一抗的PBS作為陰性對照,行SP法免疫組織化學(xué)染色以eNOS為一抗(1∶200),二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.4 鏡下觀察及圖像分析

1.4.1eNOS陽性反應(yīng)灰度積分 在eNOS染色之后,隨機選取3張從每組標本的切片中,光鏡下對比觀察對照組與實驗組eNOS表達陽性區(qū)域的分布。隨機選5個非重疊視野(×200)從每張切片中以測定eNOS陽性反應(yīng)強度灰度,轉(zhuǎn)化為灰度積分=陽性產(chǎn)物面積/測量面積×陽性強度灰度值。

1.4.2新生血管計數(shù) 按照文獻標準Weidner方法[5],首先查找血管密集區(qū)于低倍鏡下,再將每個視野中的微血管數(shù)于高倍視野下(×200)計數(shù):即微小血管由2-3個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇構(gòu)成,而以下情況均不計數(shù):達8個紅細胞大小的血管,管腔帶有較厚肌層或由5個以上內(nèi)皮細胞構(gòu)成管腔。隨機選5個非重疊視野,測定值取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 光鏡觀察

2.1.1HE染色 實驗組與對照組相似,因機械牽拉牙周膜分為壓力側(cè)和張力側(cè),壓力側(cè)牙周膜纖維排列紊亂;張力側(cè)牙周膜纖維排列具有方向性。而實驗組可見更為豐富的微血管。

2.1.2eNOS免疫組織化學(xué)染色 eNOS免疫組化染色呈棕黃色顆粒的為陽性表達,實驗組和對照組各時間點均有不同程度陽性表達,強度隨著時間呈一定的變化規(guī)律。對照組陽性強度普遍低于實驗組,實驗組在血管上皮細胞、破骨細胞及成骨細胞、成纖維細胞均有不同程度陽性表達。

1天組:

對照組:張力側(cè)牙周膜增寬,血管相對擴張。壓力側(cè)牙周膜變窄,血管部分受壓,管腔形態(tài)不規(guī)則或呈梭形。eNOS在部分血管內(nèi)皮細胞中表達呈陽性(++),骨細胞中未見明顯表達(±),成纖維細胞表達呈弱陽性(+)。牙槽骨改建反應(yīng)未見(圖1)。

圖1 對照1天組牙周組織eNOS的表達(SP,×100)

實驗組:與對照組反應(yīng)基本相似。牙骨質(zhì)表面的成牙骨質(zhì)細胞可見。

3天組:

對照組:張力側(cè)牙周膜明顯增寬,血管繼續(xù)擴張。壓力側(cè)牙周膜變得紊亂,血管腔隙甚至閉塞在狹窄部分(圖2)。eNOS在血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞表達呈強陽性(+++), 在成骨細胞中也有陽性表達(圖3)。

圖2 對照3天組牙周組織(HE,×100)

圖3 對照3天組牙周組織eNOS的表達(SP,×100)

實驗組:較對照組新生血管數(shù)目多??梢姷焦俏蘸蟮墓窍莞C,同時新骨在牙槽骨表面可見形成(圖4)。eNOS在血管內(nèi)皮細胞、破骨細胞、成纖維細胞表達呈強陽性(+++),與比對照組相比增強(圖5)。

圖4 實驗3天組牙周組織(HE,×100)

圖5 實驗3天組牙周組織eNOS的表達(SP,×100)

5天組:

對照組:張力側(cè)血管擴張增生,成骨細胞成排排列, 新骨沉積于牙槽骨表面。壓力側(cè)可見新生的毛細血管,牙槽骨表面多個破骨細胞,骨吸收陷窩明顯,各類細胞eNOS表達均略有降低。

實驗組:形成更多新生的毛細血管,血管內(nèi)皮細胞、破骨細胞等eNOS呈強陽性(+++)染色,與對照組相比明顯增高(圖6)。

圖6 實驗5天組牙周組織eNOS的表達(SP,×100)

7天組:

對照組:張力側(cè)可見數(shù)目較多的成骨細胞,鑲邊樣或成排排列分布于新骨表面。血管擴張,新生血管大多分布于新生的牙槽骨周圍。壓力側(cè)可見較豐富的新生毛細血管,骨吸收明顯。各類細胞的eNOS表達強度都呈明顯降低(圖7)。

實驗組:張力側(cè)可見旺盛的新生血管,數(shù)目增多明顯;牙周膜較寬,牙槽骨可見增生反應(yīng)明顯。壓力側(cè)可見豐富的新生血管,有較小的管腔;牙周膜較窄,牙槽骨表面可見吸收較明顯(圖8)。血管內(nèi)皮細胞、破骨細胞、成纖維細胞的eNOS染色呈更強的陽性反應(yīng)較對照組(圖9)。

圖7 對照7天組牙周組織eNOS的表達(SP,×100)

圖8 實驗7天組牙周組織(HE,×100)

圖9 實驗7天組牙周組織eNOS的表達,新生血管數(shù)目較多(SP,×100)

14天組:

對照組:張力側(cè)新生牙槽骨已連成片在某些區(qū)域,可見成骨細胞分布于其表面。牙槽骨內(nèi)與牙周膜仍見較多的新生血管,大多靠近于新生的骨組織。壓力側(cè)牙周膜逐漸恢復(fù)寬度, 血管也恢復(fù)正常形態(tài),破骨減弱(圖10)。血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞eNOS呈弱陽性表達(+)。

實驗組:與對照組反應(yīng)類似,可見較多的新生血管,血管內(nèi)皮細胞、成骨細胞、成纖維細胞等eNOS表達呈弱陽性(+)。新生骨分布已成片,破骨活動少見。

圖10 對照14天組牙周組織(HE,×100)

2.2 圖像分析

2.2.1實驗性牙移動牙周組織中eNOS免疫組化染色的圖像分析 受力后第1天,實驗組與對照組牙周組織中eNOS表達無明顯差異,自第3天,實驗組高于對照組(P<0.05)。高峰均在牙齒受力后第3天出現(xiàn)。見表1。

表1 實驗組與對照組eNOS陽性反應(yīng)平均灰度積分的比較

注:P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義

2.2.2實驗性牙移動牙周組織中的新生血管計數(shù) 正畸加力后的不同天數(shù),實驗組與對照組新生血管數(shù)量的變化規(guī)律相似,均于受力后第7天出現(xiàn)高峰。在加力第3天-第7天時實驗組牙周組織新生血管計數(shù)高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 實驗組與對照組新生血管計數(shù)的比較 (個,

注:P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義

3 討論

加速正畸牙移動過程中的牙周組織改建才能加速正畸牙移動,研究牙周組織改建及牙移動的機理對正畸臨床有重要的實際意義。有研究顯示:實驗性牙移動與營養(yǎng)因素、藥物的使用等有關(guān)。如雌激素、雄激素可使實驗性牙移動減緩;而皮質(zhì)激素和甲狀腺激素將使實驗性牙移動加快。L-ARG也是一種可利用的營養(yǎng)素,因其對局部缺血組織的再生和血管發(fā)生的有益的作用,目前在臨床上已應(yīng)用于治療多種缺血性疾病,但有些方面仍在觀察研究之中。一氧化氮合酶的亞型有3種:內(nèi)皮型(endothelial nitric oxide synthase,eNOS) 、神經(jīng)元型(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)和誘導(dǎo)型(inducible nitric oxide synthase,iNOS)[6],NO是最重要的一種內(nèi)皮源性血管活性因子,介導(dǎo)和調(diào)節(jié)多種病理生理反應(yīng),具有擴張血管、組織修復(fù)等作用,以L-Arg為底物,由NOS催化生成[7]。NO途徑也是一種重要的新血管形成的調(diào)節(jié)器。研究表明外源性L-Arg能增加血管NO生物活性,明顯促進NO合成[8]。而受力反應(yīng)中NO的釋放主要由eNOS 催化產(chǎn)生。Nakago也發(fā)現(xiàn)NO增加出現(xiàn)在成纖維細胞受力后,且是eNOS促使NO增加,而不是iNOS。

本實驗結(jié)果顯示,在對照組和實驗組中eNOS都隨著時間呈一定的變化規(guī)律的表達。eNOS在血管上皮細胞、破骨細胞、成骨細胞和成纖維細胞均呈不同程度陽性表達。而且從第3天開始,eNOS表達實驗組高于對照組。說明對于實驗性牙移動的牙周組織改建這一過程eNOS參與其中,且L-Arg促進eNOS參與。分析機制可能為細胞因子如IL-1、VEGF等早期產(chǎn)生較少,則早期主要是由正畸牽引力誘使eNOS表達升高,之后伴隨細胞因子增加,如VEGF是eNOS和NO的上游調(diào)節(jié)[9],以及持續(xù)的牽引力進一步升高eNOS的表達,兩組高峰均出現(xiàn)于第3天,之后因為產(chǎn)生的NO和活化的破骨細胞可能也反過來使eNOS的活性受到抑制,同時牽引力使牙齒向其方向移動,牽張力對牙周組織的刺激減小,部分細胞因子也開始減少,降低了eNOS的表達,eNOS在這個過程中將機械力轉(zhuǎn)變?yōu)樯锘瘜W(xué)信號,起了介導(dǎo)的作用。注射L-Arg后,eNOS的表達明顯增多,說明促進了eNOS在實驗性牙移動中的參與。

本實驗中實驗組和對照組血管的增殖和再生開始于加力1天,血管化反應(yīng)高峰出現(xiàn)于7天時,在此之后降低。在加力第3天-第7天時實驗組新生血管計數(shù)高于對照組,說明在局部缺血環(huán)境中,血管形成增加與eNOS的過表達有關(guān)。這與Corbett等認為NOS 的表達可改善局部微循環(huán),增加血流量的研究結(jié)果相似。而且eNOS影響血管形成和改建,其主要產(chǎn)生不分支的、大的血管[10]。

本實驗結(jié)果還顯示,實驗組和對照組中eNOS在牙根周圍牙槽骨表面破骨細胞、成骨細胞中均有表達,提示eNOS參與早期實驗性牙移動牙周組織的骨改建。NOS和NO與骨代謝密切相關(guān)聯(lián)[11],Zaman等研究表明在機械負荷作用下,骨細胞主要表達eNOS,而iNOS及nNOS幾乎不表達。在兔下頜骨骨折愈合中也有類似情況,通過調(diào)控NOS的表達,調(diào)節(jié)了成骨細胞的增殖、分化和礦化能力,導(dǎo)致骨代謝發(fā)生改變[12]。而且實驗組中eNOS在破骨細胞、成骨細胞中的表達較對照組明顯,破骨細胞活化也明顯,破骨活躍,成骨也被促進。提示注射NO前體L-Arg促進早期實驗性牙移動牙周組織的骨改建并促進eNOS參與這一過程。分析原因近年來發(fā)現(xiàn)NO是骨反應(yīng)的重要媒介和信號分子,其參與調(diào)節(jié)破骨細胞、成骨細胞活性[13]及維持骨形態(tài)和進行骨改建,并在破骨細胞和成骨細胞的信號傳導(dǎo)進程中起重要作用[14]。如eNOS所合成的低濃度的NO可促進破骨細胞前體成熟,成骨細胞增殖,骨基質(zhì)分泌功能增加,從而進行骨改建[15,16]。因此藥物和條件的改變可以引起局部 NO 濃度的變化,從而引起骨的重塑[17]。

綜上,L-Arg通過上調(diào)實驗性牙移動牙周組織中eNOS的表達,促進eNOS參與牙周組織改建,從而在促進牙周組織的血管改建與骨改建方面發(fā)揮了作用。

猜你喜歡
實驗性牙周組織骨細胞
LncRNA在骨質(zhì)疏松中對破骨細胞作用的研究進展
李俊鵬:實驗性的“空間敘事者”,以個性與多元煥新體驗
正畸-牙周聯(lián)合治療對替牙期兒童錯位伴繼發(fā)性咬合創(chuàng)傷牙齒牙周組織的療效
破骨細胞能量代謝的研究進展
葛根素抑制小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎的作用
成骨細胞調(diào)節(jié)破骨細胞功能的機制及途徑研究進展
牙周組織再生術(shù)聯(lián)合口腔正畸治療牙周炎患者的臨床效果觀察與分析
牙周組織再生術(shù)與正畸聯(lián)合治療牙周炎患者臨床效果分析
牙周組織再生術(shù)聯(lián)合口腔正畸對牙周炎的治療作用研究
苗藥阿銳布提取物對實驗性小鼠急性肝損傷的保護作用