鄧宇鵬,王秋石,高麗娟,劉崇東

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院,北京100020)

宮腔粘連(Intrauterine adhesions,IUA)是宮腔操作的嚴(yán)重并發(fā)癥，可引起不孕、月經(jīng)過少、閉經(jīng)或反復(fù)流產(chǎn)[1]。隨著宮腔鏡技術(shù)的發(fā)展，近年IUA的發(fā)病率和檢出率呈上升趨勢，已成為女性繼發(fā)不孕的第二大病因[2]。目前，臨床對IUA的治療盡管能恢復(fù)宮腔的形態(tài)，但對子宮生理功能的恢復(fù)尚不能有效解決，導(dǎo)致IUA的治愈率和妊娠率無明顯改善，而且中重度IUA治療后的復(fù)發(fā)率較高[3]。因此，IUA仍是臨床治療的難題，IUA的預(yù)防更為重要。

目前IUA的預(yù)防方法有術(shù)后放置Foley球囊、節(jié)育環(huán)，以及雌激素/孕激素聯(lián)合治療等，但存在各種局限性。透明質(zhì)酸鈉具有良好生物相容性和生理功能，近年來也被用于IUA的預(yù)防[4,5]，但由于其易從宮腔流出(粘度低)和降解吸收過快(1-2天)的缺點，因而并未能在臨床上得到較好的推廣使用。交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠克服了透明質(zhì)酸鈉的缺點，具有很高的粘度，可在宮腔局部充填停留；同時也顯著延緩了體內(nèi)降解吸收的時間(1-2周)，與粘連預(yù)防的關(guān)鍵期限5-7天相匹配[6,7]，因而較好地預(yù)防了IUA[8,9]。醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉是一種新型交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠，在預(yù)防鼻內(nèi)鏡術(shù)后術(shù)腔粘連和促進(jìn)術(shù)后創(chuàng)傷愈合方面具有良好的療效，已在歐洲、美國及中國的臨床中得到了較好的應(yīng)用[10,12]；該凝膠的性能也適合于IUA的預(yù)防。本研究擬基于文獻(xiàn)的報道方法建立兔IUA的動物模型[13]，評估醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠在動物體內(nèi)用于宮腔粘連預(yù)防的安全性和有效性，同時也對該產(chǎn)品的宮腔粘連預(yù)防機理進(jìn)行了探討；本研究將為醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的IUA預(yù)防臨床應(yīng)用提供相關(guān)的實驗依據(jù)。

1 研究方法

1.1 試驗材料

試驗產(chǎn)品(醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠)由常州百瑞吉生物醫(yī)藥有限公司提供，共分為兩個批次：在有效期內(nèi)的批次和已過有效期的批次。試驗產(chǎn)品1：批號1110001；生產(chǎn)日期2011年10月25，有效期至2013年10月24日;試驗產(chǎn)品2：批號1404003；生產(chǎn)日期2015年04月15，有效期至2017年04月14日。脂多糖：購自Sigma公司，貨號L6529。戊巴比妥鈉：購自Solarbio公司，貨號P8410。

1.2 試驗動物及分組

成年健康雌性新西蘭大白兔 75只，體重 2.50-3.50 kg，常規(guī)條件飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，環(huán)境溫度和濕度分別保持在 18-22℃和 60%±20%。常規(guī)單籠飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境3天后隨機分為試驗A組、試驗B組和對照C組，每組25只。 試驗A組為：在行宮腔粘連造模后充填試驗產(chǎn)品1；試驗B組為：在行宮腔粘連造模后充填試驗產(chǎn)品2；對照C組為：僅行宮腔粘連造模。各組動物分組及體重情況見表1。

表1 分組及稱重情況表(Mean±SE)

各組動物的體重未見顯著性差異(P>0.05)。

1.3 試驗方法

按文獻(xiàn)方法制備兔子宮腔粘連動物模型[13]。試驗組及對照組兔術(shù)前12 h禁食水；采用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉后，仰臥位固定；取腹壁下切口打開腹腔，暴露出子宮，隨機取一側(cè)子宮，于子宮中下1/3處做0.5 cm縱切口，用直徑4 mm子宮內(nèi)膜刮勺刮取中上段子宮內(nèi)膜，當(dāng)子宮四壁粗糙時，停止刮宮，宮腔留置脂多糖棉線，棉線殘端留置于腹部，留長約3 cm尾絲，剪去多余棉線，試驗A和B組分別注入試驗產(chǎn)品1和2以充填滿整個術(shù)側(cè)宮腔(約0.3 ml)；2 d后輕拉尾絲，取出宮腔內(nèi)棉線。對照C組不注入任何防粘連材料，直接縫合，2 d后輕拉尾絲，手術(shù)均由同一人完成。動物清醒后分籠飼養(yǎng)，每籠 1只。連續(xù) 3 d肌肉注射青霉素預(yù)防感染。標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，環(huán)境溫度和濕度分別保持在 18-22℃和 60%±20%。術(shù)后不同時間點進(jìn)行存活率、血、尿等安全性實驗室檢查；并處死動物進(jìn)行觀察試驗產(chǎn)品殘留量，收集子宮組織，進(jìn)行子宮宮腔粘連情況的觀察評價；進(jìn)行HE染色和馬松三色染色，進(jìn)行子宮宮腔創(chuàng)傷愈合情況觀察評價(子宮組織內(nèi)膜腺體數(shù)量和纖維化評價)。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1存活率 一般情況觀察3組兔子術(shù)后是否存活至試驗完成；如有死亡則記錄原因。

1.4.2試驗產(chǎn)品殘留量 各組于術(shù)后3 d、7 d、14 d、21 d和28 d時處死5只動物，觀察宮腔內(nèi)試驗產(chǎn)品的殘留量；大體觀察試驗產(chǎn)品在宮腔內(nèi)的殘留情況。

1.4.3宮腔粘連情況 由于粘連需要5-7 d才能形成[6,7,14]，因此各組在術(shù)后7 d、14 d、21 d和28 d時分別對處死的5只動物檢查宮腔的粘連情況；評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。該評分標(biāo)準(zhǔn)參考了AFS 1988的宮腔粘連評分系統(tǒng)[15]；但由于兔月經(jīng)情況無法觀察，因而未包括月經(jīng)功能項的評分，改為更為客觀的子宮的組織學(xué)檢查評價(膜腺體數(shù)量及纖維化情況評價，參見1.4.4)。

表2 宮腔粘連評分標(biāo)準(zhǔn)

注：無粘連時宮腔涉及范圍得分和粘連類型得分均為0分。

1.4.4子宮組織的膜腺體數(shù)量及纖維化情況 進(jìn)行HE染色和馬松三色染色，觀察子宮組織的膜腺體數(shù)量及纖維化情況。兔子宮組織樣本的石蠟切片分別行HE染色和馬松三色染色。每張HE染色切片選取4個高倍鏡視野，計數(shù)每個視野下腺體數(shù)量，取其平均值。纖維化面積比率計算方法：每張馬松三色染色切片選取4個視野，纖維化面積比率為每個視野子宮內(nèi)膜間質(zhì)纖維化的總面積除以子宮內(nèi)膜間質(zhì)和腺體面積之和，取平均值，以圖像分析系統(tǒng)自動計算完成。

1.4.5實驗室檢查情況 術(shù)后3 d、28 d進(jìn)行血常規(guī)、血生化、尿常規(guī)檢查。

2 結(jié)果

2.1 存活率

三組兔子按照前述實驗方法施行手術(shù)。各組動物經(jīng)手術(shù)后生命體征平穩(wěn)，自主活動能力稍恢復(fù)。每天兩次觀察，試驗A組、試驗B組及對照C組均未出現(xiàn)死亡及感染情況，存活率為100%。

2.2 試驗產(chǎn)品殘留量

后3 d、7 d、14 d、21 d和28 d時各組分別處死5只動物以觀察宮腔內(nèi)試驗產(chǎn)品的殘留量。經(jīng)大體觀察，發(fā)現(xiàn)試驗產(chǎn)品1和2的殘留量基本相一致，均隨著時間逐漸降解消失；術(shù)后3 d時試驗產(chǎn)品均充滿整個術(shù)側(cè)宮腔，7 d時仍有較多試驗樣品充滿大部分術(shù)側(cè)宮腔(約75%宮腔體積)，至14 d時試驗樣品完全降解消失。

2.3 宮腔粘連情況

術(shù)后7 d、14 d、21 d和28 d分別檢查宮腔粘連情況并評分；粘連得分見下表3。術(shù)后7 d、14 d、21 d和28 d，試驗A組和B組的宮腔粘連得分均顯著低于對照C組(P<0.05)，即與對照C組相比，試驗產(chǎn)品1和2均顯著預(yù)防了宮腔粘連。與術(shù)后7 d相比，各組術(shù)后14 d時宮腔粘連得分有所降低，可能與后期炎癥反應(yīng)及其引起的腫脹逐漸消退有關(guān)，大體上可能表現(xiàn)為粘連涉及范圍稍有減少；自術(shù)后14 d起始，粘連穩(wěn)定形成，因此粘連得分趨于穩(wěn)定。上述現(xiàn)象與粘連形成的機理及過程相一致[6,7,14]。

2.4 子宮組織內(nèi)膜腺體數(shù)量及纖維化情況

術(shù)后各觀察時間點取兔子宮組織切片進(jìn)行HE染色和馬松三色染色，觀察子宮組織的膜腺體數(shù)量及纖維化情況。

表3 各組宮腔粘連評分

正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)微血管豐富；馬松染色鏡下觀察見黏膜、黏膜下層、血管和肌肉呈暗紅色；子宮內(nèi)膜間質(zhì)膠原纖維呈藍(lán)色，梭狀，排列較整齊。術(shù)后3 d，試驗A組、試驗B組和對照C組均在宮腔內(nèi)偶有扁平上皮細(xì)胞再生，宮腔內(nèi)出現(xiàn)大量纖維性滲出液以及壞死組織碎片；間質(zhì)出血，水腫，淋巴細(xì)胞浸潤，部分區(qū)域纖維化，膠原纖維增加；部分毛細(xì)血管管腔閉鎖。術(shù)后7 d，對照C組宮腔部分閉鎖，縱行剖開，大體觀察可見一些較牢固纖維性粘連帶；鏡下可見纖維性粘連帶增厚，70%-80%未粘連區(qū)域覆蓋扁平上皮細(xì)胞，上皮層下可見極少量腺體；80%-90%間質(zhì)區(qū)纖維化增生，膠原纖維聚集，間質(zhì)毛細(xì)血管稀少。試驗A和B組的組織學(xué)形態(tài)基本相同；與對照C組相比，試驗A和B組鏡下纖維化面積均較對照C組減少，同時腺體比對照C組增多。

術(shù)后14 d至28 d時，各組的宮腔組織學(xué)形態(tài)與術(shù)后7 d時類似。對照C組術(shù)后28 d時子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)仍未恢復(fù)，宮腔瘢痕粘連化明顯；試驗A組和B組28 d子宮內(nèi)膜形態(tài)基本恢復(fù)，宮腔基本無瘢痕粘連。

表4 術(shù)后7 d兔子宮內(nèi)膜纖維化面積比率與腺體數(shù)量比較(Mean±SE)

試驗A組和B組的纖維化面積比率(%)和腺體數(shù)量相近(P>0.05)，均顯著優(yōu)于對照C組(P<0.05)，即與對照C組相比，試驗產(chǎn)品1和2的使用均顯著減少了纖維化面積比率(%)和均顯著增加了腺體數(shù)量(表4)。

2.5 血尿生化指標(biāo)檢測:術(shù)后3 d、28 d進(jìn)行血常規(guī)、血生化、尿常規(guī)檢查；結(jié)果見表6-1至6-6，各組之間均不存在顯著差異(P>0.05)。

表6-1 術(shù)后3 d血常規(guī)

表6-2 術(shù)后3 d血生化

表6-3 術(shù)后3 d尿常規(guī)

表6-4 術(shù)后28 d血常規(guī)

表6-5 術(shù)后28 d血生化

表6-6 術(shù)后28 d尿常規(guī)

3 討論

組織粘連形成機制已經(jīng)得到廣泛的研究，主要機制包括：組織損傷后即刻觸發(fā)了系列的級聯(lián)反應(yīng)(血管通透性增加；釋放出組胺、激肽類等活性因子)；在3小時內(nèi)產(chǎn)生成纖滲出物，并逐步沉積；正常情況下，成纖滲出物可在72小時內(nèi)被清除；然而損傷降低了局部溶纖活性，因而不能快速分解清除成纖滲出物，從而形成了前期的纖維性粘連；隨后成纖細(xì)胞快速侵入并伴隨血管生成，形成了永久的含血運的組織疤痕粘連[6,7,14]。粘膜的愈合與皮膚的愈合不同，為自創(chuàng)傷底部起始的上皮化過程，因而愈合較快，粘膜上皮化的關(guān)鍵期限是5-7天，術(shù)后粘連預(yù)防的關(guān)鍵是在5-7天內(nèi)物理隔離尚未完全上皮化的粘膜表面[6,7,14]。

在本動物試驗研究中，術(shù)后3天時觀察到了大量的纖維性滲出物，呈現(xiàn)出嚴(yán)重的急性炎癥反應(yīng)；術(shù)后7天時，粘連已穩(wěn)定形成，至術(shù)后14天起不再發(fā)生變化。試驗產(chǎn)品在宮腔內(nèi)的停留時間約為7-14天，可在5-7天內(nèi)的粘膜關(guān)鍵上皮化期限內(nèi)較好地隔離尚未完全上皮化的粘膜表面，因而較好地預(yù)防了宮腔粘連。此外，透明質(zhì)酸鈉具有的調(diào)控炎癥反應(yīng)、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的多重功能也可能通過促進(jìn)粘膜上皮化的進(jìn)程，從而達(dá)到更好預(yù)防宮腔粘連的功效[16]。