張娟娟，張春蓮，張志軍，王超云

上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)是婦科常見惡性腫瘤，國內報道顯示其發(fā)病率及病死率均呈上升趨勢[1-2]。由于該疾病起病隱匿，早期癥狀不典型，多數病人確診時已為晚期，即便接受標準化的治療方案，病人預后仍不理想[3]。早期預測病人預后，制定針對性的治療方案，有助于改善病人結局[4]。腫瘤干細胞是腫瘤組織中具備自我更新、無限增殖、成瘤能力強，且可影響腫瘤侵襲、轉移及抗放化療的細胞[5]；上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)可使腫瘤細胞擺脫細胞間粘附，從而提升其侵襲能力[6]。CD133蛋白是腫瘤干細胞重要標志物，Snail、E-cadherin蛋白是反應EMT的重要標志物，已有研究證實上述蛋白與EOC病人預后具有一定的相關性[7-8]，但目前尚缺乏能夠具體預測病人術后生存情況的模型。因此，本研究利用Cox風險比例模型、R語言構建病人術后生存情況的列線圖模型，有助于解決上述問題，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2009年1月至2012年1月于十堰市太和醫(yī)院接受治療的152例EOC病人為對象，進行持續(xù)隨訪研究，隨訪截至病人死亡或至2017年10月，隨訪時間為6～103個月。病人年齡范圍為27～82歲，年齡(58.45±12.17)歲，其中<55歲78例，≥55歲74例；組織學分型：漿液性癌107例、黏液性癌24例、宮內膜樣癌12例、透明細胞癌9例；國際婦產科聯盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)手術病理分期[9]Ⅰ～Ⅱ期74例、Ⅲ～Ⅳ期78例；腫瘤最長直徑≥5 cm者56例、<5 cm者96例；伴腹部臟器或淋巴結轉移者56例；伴腹水者53例。

1.2 納入標準 術后病理確診為上皮性卵巢癌；初治病人，均選擇腫瘤細胞減滅術治療，術后接受以鉑類為主的聯合化療；病理、臨床及隨訪資料完整；本研究符合《世界醫(yī)學協會赫爾辛基宣言》相關要求，病人及近親屬知情同意。

1.3 排除標準 既往已接受放療、化療或其他抗腫瘤治療者；隨訪期間失訪者。

1.4 方法

1.4.1 實驗室檢測 試劑：鼠抗人CD133單克隆抗體，兔抗人Snail多克隆抗體，購自美國Abcam；鼠抗人E-cadherin多克隆抗體、DAB顯色試劑盒、ElivisionTMplus試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。方法：收集所有對象存檔的手術標本石蠟塊，4 μm連續(xù)切片、烤干，脫蠟至水洗后參考試劑盒說明書進行免疫組織化學染色，選用已知陽性切片為陽性對照，以PBS代替一抗為空白對照。結果判定：由3名病理醫(yī)師采用多數法獨立雙盲閱片判斷免疫組織化學染色結果。CD133、E-cadherin蛋白陽性以細胞膜和細胞質出現棕黃色顆粒為準，Snail陽性以細胞核出現棕黃色顆粒為準，表達結果從著色強度和范圍兩方面綜合計分。著色強度：0、1、2、3分分別表示無色、淡黃色、棕黃色、棕褐色；著色范圍：1、2、3、4分分別表示高倍鏡下陽性細胞占比<10%、11%～50%、51%～75%、>75%，兩者得分乘積為最終得分，積分≤2分為標本陰性，>2分為陽性。每個標本隨機計數10個×400倍視野，取中位值進行判定。

1.4.2 觀察指標 統計病人年齡、FIGO 手術病理分期、組織學分型、腫瘤直徑、轉移及腹水情況。采用電話、門診復查及上門隨訪等方式對病人進行持續(xù)隨訪，觀察病人生存情況。

1.5 統計學方法 采用SPSS 19.0及R語言3.4.2版進行數據統計分析。單因素分析采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-rankχ2檢驗進行單因素分析，采用Cox風險比例模型進行多因素分析，以明確病人累積生存率的影響因素，自變量篩選方案選擇條件參數估計似然比檢驗，進入標準P<0.05，刪除標準P>0.10。根據上述影響因素的回歸系數等信息，利用R語言構建累積生存率的列線圖模型和校準曲線。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD133、E-cadherin、Snail表達情況 152份病理標本中，CD133陽性表達87例，占57.24%(87/152)，E-cadherin陽性表達50例，占32.89%(50/152)，Snail陽性表達89例，占58.55%(89/152)。

2.2 CD133、E-cadherin、Snail表達與累積生存情況的關系 病人中位生存時間51月(95%CI：44.637～57.363月)，1年、3年、5年累積生存率分別為93.4%、63.3%、37.5%。CD133、Snail陽性者，累積生存時間明顯短于對應陰性者(Log-rankχ2=25.762，P<0.001；Log-rankχ2=16.463，P<0.001)，E-cadherin陰性者，累積生存時間明顯短于陽性者(Log-rankχ2=37.159，P<0.001)，見圖1。

2.3 累積生存率的影響因素分析 經Log-rankχ2檢驗，除CD133、E-cadherin、Snail表達情況外，FIGO分型Ⅲ～Ⅳ期、伴腹部臟器或淋巴結轉移病人累積生存時間也分別明顯短于FIGO分型Ⅰ～Ⅱ期、不伴腹部臟器或淋巴結轉移病人(Log-rankχ2=7.373，P=0.007；Log-rankχ2=31.023，P<0.001)，而年齡、組織學分型、腫瘤最長直徑、腹水均與累積生存時間無明顯關系(P>0.05)。將CD133、E-cadherin、Snail、FIGO分型、腹部臟器或淋巴結轉移作為自變量，按如下方案賦值：CD133、E-cadherin、Snail陽性為1，陰性為0，FIGO分型Ⅰ～Ⅱ期為1，Ⅲ～Ⅳ期為2，有伴腹部臟器或淋巴結轉移為1，無為0，將累積生存情況納為因變量，經Cox風險比例模型分析顯示，CD133陽性、伴腹部臟器或淋巴結轉移是影響病人預后的危險因素，E-cadherin陽性是影響病人預后的保護因素(P<0.05)，見表1。

圖1 CD133、E-cadherin、Snail表達與上皮性卵巢癌累積生存情況的關系：A為總體情況；B為CD133與累計生存情況的關系；C為E-cadherin與累計生存情況的關系；D為Snail與累計生存情況的關系

指標β值標準誤Waldχ2值P值HR(95%CI)CD133陽性 0.5600.2276.1060.0131.751(1.123～2.730)E-cadherin陽性-0.9050.22216.5780.0000.405(0.262～0.625)伴腹部臟器或淋巴結轉移0.4200.2143.8540.0501.523(1.001～2.317)

2.4 病人預后的預測列線圖模型建立 根據Cox風險比例模型分析結果，建立基于CD133、E-cadherin是否陽性及有無伴腹部臟器或淋巴結轉移的列線圖模型用于預測病人1年、3年、5年生存率，如圖2。

列線圖預測值的實例：某病人CD133、E-cadherin均陽性，伴腹腔臟器轉移，則該病人的總評分為：64+0+44=108分，對應的術后1年生存率高于95%，3年生存率約為69%，5年生存率低于50%。

2.5 列線圖模型驗證 經內部驗證，該模型一致性參數C-index=0.699，校準圖形接近于斜率為1的直線，提示列線圖較準確地預測病人術后死亡風險。見圖3。

3 討論

腫瘤組織中多數細胞增殖能力有限，數次分裂后就會死亡，但小群細胞具備無限增殖和分化的潛能，這是腫瘤形成、侵襲和轉移的重要基礎，此類細胞即腫瘤干細胞[10]。CD133可以作為卵巢癌腫瘤干細胞標志物[11]，其高表達多與FIGO高分期、腫瘤轉移有關[12]，據文獻報道，聯合CD133檢測對EOC病人的早期診斷、治療及預后可能有參考價值[13]。本研究CD133陽性可明顯縮短病人累積生存時間，提示腫瘤干細胞水平與病人預后存在一定的相關性。EMT具有細胞極性消失、黏附力下降、細胞骨架重塑，且獲得間充質細胞遷移、侵襲及抗凋亡的生物學特性，腫瘤細胞出現EMT變化，則能夠獲得干細胞特性[14]。EMT過程受不同生長因子和信號通路轉導信號共同調節(jié)，相關研究提示Snail/E-cadherin信號通路與EMT密切相關[15]：E-cadherin是廣泛存在于上皮組織的鈣依賴性細胞粘附分子；Snail能夠與其啟動子區(qū)域含有CAGGTG核心堿基序列的E-box元件結合，從而抑制E-cadherin表達，導致細胞粘附下降，腫瘤細胞易脫落并轉移。Zhang等[16]發(fā)現高Snail表達、低E-cadherin表達多與FIGO高分期、腫瘤轉移有關。本研究證實Snail陽性表達者及E-cadherin陰性表達者，其累積生存時間明顯縮短，提示EMT與病人預后有一定相關性。已有研究證實發(fā)生EMT的細胞能夠促使腫瘤干細胞亞群數量提升，從而使腫瘤細胞獲得干性，同時，腫瘤干細胞又具備間質樣細胞的特點，能夠表達EMT相關因子，促進EOC腫瘤干細胞的干性特征產生及CD133表達，從而導致腫瘤的侵襲性增強，嚴重影響病人預后[17]。

圖2 根據上皮性卵巢癌病人預后影響因素建立的列線圖模型

圖3 列線圖預測上皮性卵巢癌病人累積生存率的校準曲線

Cox風險比例模型指出僅CD133、E-cadherin表達及是否伴腹部臟器或淋巴結轉移與病人預后相關，其剔除了Snail表達情況，可能因后者對病人預后的影響被其它因素掩蓋所致。目前對EOC病人預后影響因素的測評，主要基于Cox回歸模型[18-19]，雖有一定指導價值，但難以為個體病人提供準確、具體的生存率信息，仍不能滿足臨床需求。本研究利用Cox回歸分析結果，結合R語言，構建預測病人生存率的列線圖模型，結果顯示其具備良好的內部一致性和預測效能，可能能夠為日后開展同類研究提供參考，即構建列線圖模型有助于為病人提供個體化的生存率預測信息，這與其他腫瘤報道[20-21]結論一致。

綜上，CD133及E-cadherin表達情況是EOC病人預后的影響因素，構建列線圖能夠有效預測病人生存率。從發(fā)展前景來看，CD133及E-cadherin聯合檢測有可能成為評估EOC病人臨床預后的重要參考指標，有必要在嚴格設計的大樣本、多中心研究中進一步驗證。