張素婷，張 濤，黃 健，劉長今，駱詩露，閔 迅

(1. 遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，貴州 遵義 563000； 2. 遵義醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000)

由于各種抗菌藥物的不斷更新?lián)Q代，免疫抑制劑的不斷應(yīng)用，以及支持治療手段的不斷進(jìn)步，臨床真菌感染的患病率和致死率均較前明顯上升[1]。當(dāng)前，臨床常見真菌主要以酵母型真菌和絲狀真菌感染所致危害最大，并且逐漸成為醫(yī)院感染的重要類型之一。臨床上對真菌的檢測主要有直接涂片法、真菌培養(yǎng)法以及病理學(xué)組織檢查等傳統(tǒng)方法，而針對真菌的早期診斷則多以檢測速度和準(zhǔn)確性更好的G實驗、GM實驗以及PCR等方法為主。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜 (matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS) 是近年發(fā)展起來的一種簡便、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟的病原微生物鑒定方法[2]，其初期主要用于臨床細(xì)菌的鑒定。近年來，有學(xué)者將其應(yīng)用到臨床病原真菌的鑒定領(lǐng)域。目前，臨床上主要以法國bioMérieux公司生產(chǎn)的Vitek MS，以及德國Bruker公司生產(chǎn)的Biotyper的應(yīng)用最為廣泛。MALDI-TOF MS技術(shù)在細(xì)菌鑒定方面已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，但其在真菌鑒定能力方面的相關(guān)報道仍然較少[3-4]。因此，本研究擬針對不同MALDI-TOF MS分析系統(tǒng)對臨床常見真菌鑒定的準(zhǔn)確性方面進(jìn)行Meta分析，為臨床真菌感染的診斷及治療提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)研究類型：可提供MALDI-TOF MS技術(shù)檢測真菌的真陽性(true positive, TP)、假陽性(false positive, FP)、假陰性(false negative, FN)、真陰性(true negative, TN)的文獻(xiàn)；(2)研究對象：臨床血液、體液培養(yǎng)標(biāo)本中分離的真菌菌株，或真菌標(biāo)準(zhǔn)菌株；(3)診斷實驗方法：待檢測技術(shù)為MALDI-TOF MS，以常規(guī)檢測方法或分子生物學(xué)方法為金標(biāo)準(zhǔn)；(4)結(jié)局指標(biāo)：合并靈敏度(sensitivity, Sen)、特異度(specificity, Spe)、陽性似然比(positive likelihood ratio, +LR)、陰性似然比(negative likelihood ratio, -LR)、診斷比值比(diagnostic odds ratio, DOR)和匯總受試者工作特征(summary receiver operating characteristic, SROC)曲線下面積(area under curve, AUC)。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)重復(fù)文獻(xiàn)，與MALDI-TOF MS檢測真菌準(zhǔn)確性不相關(guān)文獻(xiàn)；(2)無詳細(xì)數(shù)據(jù)的會議摘要、綜述和專利等。

1.3 檢索策略 計算機檢索PubMed、Embase、Cochrane Library、中國知網(wǎng)(CNKI)、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(CBM)、維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(簡稱維普)、萬方數(shù)據(jù)庫，查找MALDI-TOF MS與傳統(tǒng)方法或分子生物學(xué)方法比較檢測真菌準(zhǔn)確性的文獻(xiàn)，檢索時限均為建庫至2018年6月30日。采用自由詞與主題詞相結(jié)合的方式進(jìn)行檢索。中文檢索詞包括：基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜、真菌、酵母菌屬、絲狀真菌屬、隱球菌屬、鑒定。英文檢索詞包括：MALDI-TOF MS、MALDI-TOF、fungus、yeasts、filamentous fungi、identification。

1.4 文獻(xiàn)篩選和資料提取

1.4.1 研究的選擇與資料提取 由2名研究人員根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)獨立進(jìn)行文獻(xiàn)篩選，并對最終納入文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行提取，如有不一致則交由第三方解決。提取的內(nèi)容包括：第一作者、發(fā)表年限、菌株株數(shù)、菌株類別、檢測儀器、數(shù)據(jù)庫、菌種來源、TP、FP、FN、TN等相關(guān)信息。

1.4.2 文獻(xiàn)質(zhì)量評價 文獻(xiàn)質(zhì)量采用QUADAS-2工具進(jìn)行評價[5]。QUADAS-2工具包括偏倚評價和臨床適用性兩部分。偏倚評價包括病例選擇、待評價試驗、金標(biāo)準(zhǔn)、病例流程和進(jìn)展情況四個部分，臨床適用性則只包括前三個部分。所有領(lǐng)域的評價分為高風(fēng)險、低風(fēng)險、不清楚，并以高風(fēng)險得0分、低風(fēng)險得1分、不清楚得0.5分計算出每篇文獻(xiàn)的得分。質(zhì)量評價由兩名研究人員獨立完成，如遇分歧則尋求第三方幫助。

1.5 統(tǒng)計分析 首先繪制受試者工作特征(ROC)平面圖，判斷是否為“肩膀狀”分布，并且計算Spearman相關(guān)系數(shù)，以分析有無閾值效應(yīng)。若無閾值效應(yīng)，則計算合并Sen、Spe、+LR、-LR。采用Q檢驗分析各研究間是否存在異質(zhì)性，以I2估算分析異質(zhì)性大小。當(dāng)各研究結(jié)果間存在異質(zhì)性時，采用隨機效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析，并采用亞組分析探討異質(zhì)性來源；當(dāng)各研究結(jié)果間不存在異質(zhì)性時，則采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析。采用Meta-Disc 1.4軟件計算合并的Sen、Spe、+LR、-LR以及DOR，繪制SROC曲線、AUC。Meta分析的檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索納入和篩選流程 初步檢索到文獻(xiàn)1 222篇，其中CNKI 120篇、維普97篇、萬方數(shù)據(jù)庫58篇、CBM 281篇、PubMed 321篇、Embase 345篇，最終納入符合標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)26篇[6-31]。文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果見圖1。

圖1 MALDI-TOF MS鑒定常見真菌準(zhǔn)確性Meta分析納入文獻(xiàn)篩選流程圖

Figure 1 Flow chart of literature screening for Meta-analysis on accuracy of MALDI-TOF MS in identifying common fungi

表1 MALDI-TOF MS鑒定常見真菌準(zhǔn)確性Meta分析納入文獻(xiàn)的基本特征

2.2 納入文獻(xiàn)的基本特征 26篇文獻(xiàn)的基本特征見表1。研究共包括9 708株真菌，其中酵母菌屬6 859株，絲狀真菌屬2 849株；18篇文獻(xiàn)[6-7,9-11,13,15,17-19,21-24,26-28,30]采用常規(guī)方法作為參考方法，3篇文獻(xiàn)[12,14,25]采用分子生物學(xué)技術(shù)作為參考方法，5篇文獻(xiàn)[8,16,20,29,31]采用分子生物學(xué)技術(shù)和常規(guī)方法作為參考方法，所有文獻(xiàn)均可獲取MALDI-TOF MS 鑒定真菌的TP、FP、FN、TN。

2.3 納入研究的偏倚風(fēng)險評價 26篇文獻(xiàn)評分介于5.0～7.0分，中位數(shù)為6.5分，均為較高質(zhì)量文獻(xiàn)。見表2。

表2 MALDI-TOF MS鑒定常見真菌準(zhǔn)確性Meta分析納入文獻(xiàn)的偏倚風(fēng)險評價

Table 2 Bias risk assessment on included literatures for Meta-analysis on accuracy of MALDI-TOF MS in identifying common fungi

文獻(xiàn)來源偏倚風(fēng)險①②③④適用性①②③得分Bader [6](2011)LRLRURLRLRLRLR6.5Berrio [7](2018)LRLRURLRLRLRLR6.5de Respinis [8](2013)URURLRLRURLRUR5.0Durán-Valle[9](2014)LRLRURLRLRLRLR6.5Elbehiry [10](2017)LRLRURLRLRLRLR6.5Galán [11](2015)LRLRURLRLRLRLR6.5Gracheva [12](2013)LRLRURLRLRLRLR6.5Huang [13](2017)LRLRURLRLRLRLR6.5Iranzo [14](2011)LRLRURLRLRLRLR6.5Jensen[15](2012)LRLRURLRLRLRLR6.5Lacroix [16](2014)LRLRURLRLRLRUR6.0Li [17](2018)LRLRURLRLRLRLR6.5Marklein [18](2009)LRLRURLRLRLRLR6.5Najafzaden [19](2018)LRLRURLRLRLRLR6.5Ninghui [20](2015)LRLRURLRLRLRUR6.0Posteraro [21](2012)LRLRURLRLRLRLR6.5Ranque [22](2012)LRLRURLRLRLRLR6.5Ranque [23](2014)LRLRLRLRLRLRLR7.0Reich [24](2009)URURURLRURLRLR5.0Ruiz [25](2018)LRLRURLRLRLRLR6.5Rychert [26](2018)LRLRURLRLRLRLR6.5Sariguzel [27](2015)LRLRURLRLRLRLR6.5Sow [28](2015)LRLRURLRLRLRLR6.5Westblade [29](2013)LRLRURLRLRLRUR6.0彭陽 [30](2017)LRLRURLRLRLRLR6.5奚海燕 [31](2015)LRLRURLRLRLRUR6.0

①：病例選擇；②：待評價實驗；③：金標(biāo)準(zhǔn)；④：病例流程和進(jìn)展；LR：低風(fēng)險；HR：高風(fēng)險；UR：未知風(fēng)險

2.4 Meta分析結(jié)果

2.4.1 異質(zhì)性檢驗結(jié)果 ROC平面圖不呈“肩臂狀”分布，Spearman相關(guān)性分析顯示相關(guān)系數(shù)為-0.013，P=0.949，提示不存在閾值效應(yīng)。見圖2。異質(zhì)性檢驗結(jié)果提示存在明顯異質(zhì)性，采用隨機效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析，結(jié)果顯示，MALDI-TOF MS鑒定真菌準(zhǔn)確性的Sen合并=0.97[95%CI(0.97～0.97)]、Spe合并=0.85[95%CI(0.81-0.88)]、+LR合并=5.60[95%CI(4.55～6.90)]、-LR合并=0.02[95%CI(0.01～0.04)]、DOR=282.40[95%CI(149.50～533.46)]。見圖3、4。

圖2 MALDI-TOF MS鑒定真菌準(zhǔn)確性的SROC曲線

Figure 2 SROC curve of the accuracy of MALDI-TOF MS for fungal identification

圖3 MALDI-TOF MS鑒定真菌靈敏度的Meta分析

Figure 3 Meta-analysis on sensitivity of MALDI-TOF MS for fungal identification

2.4.2 亞組分析結(jié)果 (1)菌株來源：納入的26篇文獻(xiàn)中，有5篇[7,20-22,27]研究菌株來源于標(biāo)準(zhǔn)菌株，Meta分析結(jié)果顯示，Sen合并=0.99[95%CI(0.97～1.00)]，Spe合并=0.74[95%CI(0.55～0.88)]；17篇[6,8,11-17,19,23,25-26,28-31]研究菌株來源于臨床分離株，Meta分析結(jié)果顯示，Sen合并=0.97[95%CI(0.96～0.97)]，Spe合并=0.86[95%CI(0.82～0.89)]；4篇[9-10,18,24]研究菌株兩種來源均有，Meta分析結(jié)果顯示，Sen合并=1.00[95%CI(0.99～1.00)]，Spe合并=0.86[95%CI(0.73～0.94)]；兩種單一菌種來源的文獻(xiàn)DOR值相當(dāng)，而同時滿足兩種菌株來源的文獻(xiàn)，其DOR高于單個菌株來源的文獻(xiàn)。(2)菌種：有17篇文獻(xiàn)[6-7,9,11-12,14-20,25,27-29,31]研究的對象是酵母菌屬，Meta分析的結(jié)果顯示，Sen合并=0.97[95%CI(0.97～0.98)]，Spe合并=0.87[95%CI(0.82～0.91)]；9篇文獻(xiàn)[8,10,13,21-24,26,30]研究的對象是絲狀真菌屬，Meta分析結(jié)果顯示，Sen合并=0.96[95%CI(0.96～0.97)]，Spe合并=0.83[95%CI(0.78～0.88)]；兩種不同菌種文獻(xiàn)的DOR值相當(dāng)。(3)參考方法：3篇文獻(xiàn)[12,14,25]僅采用分子生物學(xué)方法作為參考，Meta分析結(jié)果顯示，Sen合并=0.91[95%CI(0.89～0.93)]，Spe合并=0.85[95%CI(0.66～0.96)]；18篇文獻(xiàn)[6-7,9-11,13,15,17-19,21-24,26-28,30]僅采用常規(guī)方法作為參考，Meta分析結(jié)果顯示，Sen合并=0.97[95%CI(0.96～0.97)]，Spe合并=0.85[95%CI(0.80～0.89)]；5篇文獻(xiàn)[8,16,20,29,31]采用兩種方法作為參考，Meta分析結(jié)果顯示，Sen合并=0.99[95%CI(0.98～0.99)]，Spe合并=0.87[95%CI(0.77～0.93)]；僅采用分子生物學(xué)方法研究的DOR值低于常規(guī)方法和同時采用兩種方法研究的DOR值。(4)儀器：15篇文獻(xiàn)[6-10,17,20,22,24-29,31]采用bioMérieux，Meta分析結(jié)果顯示，Sen合并=0.96[95%CI(0.96～0.97)]，Spe合并=0.83[95%CI(0.75～0.89)]；11篇文獻(xiàn)[11-16,18-19,21,23,30]采用Bruker，Meta分析結(jié)果顯示，Sen合并=0.98[95%CI(0.97～0.98)]，Spe合并=0.86[95%CI(0.82～0.90)]，Bruker檢測真菌準(zhǔn)確性DOR值高于bioMérieux。見表3。

圖4 MALDI-TOF MS鑒定真菌特異度的Meta分析

Figure 4 Meta-analysis on specificity of MALDI-TOF MS for fungal identification

表3 MALDI-TOF MS鑒定真菌準(zhǔn)確性的亞組分析

3 討論

MALDI-TOF MS 是近年來廣泛應(yīng)用于臨床微生物實驗室病原菌鑒定的一項技術(shù)，在病原菌分型、耐藥檢測、毒力因子鑒定等方面發(fā)揮著重要作用[32-36]。該技術(shù)在細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用比較成熟，但在真菌鑒定尤其是絲狀真菌鑒定中的應(yīng)用缺少臨床實踐和經(jīng)驗積累[37]。本研究納入文獻(xiàn)26篇，9 708株真菌,基本涵蓋了臨床常見真菌，其中酵母菌屬占70.7%，絲狀真菌屬占29.3%。ROC曲線將Sen與Spe以圖示方法結(jié)合在一起，可準(zhǔn)確反映某分析方法Sen和Spe的關(guān)系，是試驗準(zhǔn)確性的綜合代表。本研究ROC曲線顯示，MALDI-TOF MS的AUC為0.9078，Q*統(tǒng)計量為0.8397，說明MALDI-TOF MS鑒定臨床常見真菌具有較高的準(zhǔn)確性。此外，似然比(likelihood ratio, LR) 檢驗是反映真實性的一種指標(biāo)，該指標(biāo)全面反映篩檢試驗的診斷價值。本研究得出的+LR合并為5.60，-LR合并為0.02，提示陽性結(jié)果及陰性結(jié)果均有較高的準(zhǔn)確性。

鑒于本研究中ROC平面圖不呈典型的“肩臂狀”分布，提示本文納入的文獻(xiàn)間可能存在異質(zhì)性。經(jīng)Spearman相關(guān)系數(shù)檢驗，該異質(zhì)性與閾值效應(yīng)無關(guān)，因此，本研究進(jìn)一步采用隨機效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析，結(jié)果顯示，MALDI-TOF MS 在真菌鑒定上具有極高的Sen合并(0.97)及Spe合并(0.85)，說明MALDI-TOF MS對真菌感染有較低的漏診率和誤診率。亞組分析結(jié)果顯示：(1)MALDI-TOF MS技術(shù)對真菌臨床菌株組、標(biāo)準(zhǔn)菌株組、臨床菌株+標(biāo)準(zhǔn)菌株組鑒定的Sen及Spe相近；其對兩種菌株組鑒定的DOR值高于單個菌株來源組，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(2)MALDI-TOF MS技術(shù)對臨床常見酵母菌屬及絲狀真菌屬鑒定的Sen、Spe及DOR值相當(dāng)。(3)Bruker品牌MALDI-TOF MS儀器對臨床常見真菌鑒定的Sen、Spe及DOR值均高于bioMérieux品牌，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果提示MALDI-TOF MS技術(shù)對臨床酵母菌屬及絲狀真菌屬的鑒定，不受菌株來源、儀器品牌等因素影響，均具有很好地鑒定效果。但在MALDI-TOF MS技術(shù)與不同的參考方法比較中，分子生物學(xué)組的Sen最低[Sen合并=0.91，95%CI(0.89～0.93)]，且該組的DOR值較常規(guī)方法組和同時采用兩種方法組均偏低，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)?？赡芘c前者僅納入3篇文獻(xiàn)，在一定程度上造成了DOR值偏倚所致。本Meta回歸結(jié)果提示，參考方法的不同可能是導(dǎo)致臨床常見真菌鑒定結(jié)果存在異質(zhì)性的重要原因。

盡管MALDI-TOF MS技術(shù)在臨床真菌鑒定方面得到了長足發(fā)展，但其仍存在以下不足：臨床常見病原真菌的參考質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫尚不夠完善；檢測前標(biāo)本的預(yù)處理及蛋白提取尚未能建立標(biāo)準(zhǔn)化程序；在不同的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時間，真菌蛋白表達(dá)差異可能會影響鑒定結(jié)果[38]。此外，少數(shù)臨床真菌因缺乏特異性峰值或峰數(shù)目不足，從而導(dǎo)致其產(chǎn)生的譜值過低而不能鑒定[39]，以及MALDI-TOF MS 技術(shù)對真菌耐藥性檢測方法尚未取得突破性進(jìn)展等，均是影響MALDI-TOF MS 技術(shù)在臨床廣泛應(yīng)用的主要原因。

此外，本Meta分析尚存在以下局限性：(1)由于臨床感染真菌多達(dá)400余種，因此存在檢索文獻(xiàn)不全的情況，而且檢索范圍多局限在已經(jīng)發(fā)表的英文及中文文獻(xiàn)，對于未公開發(fā)表的研究可能造成漏檢。(2)MALDI-TOF MS 技術(shù)在真菌耐藥性檢測的診斷性試驗中，由于多數(shù)研究未報告是否采用盲法檢測，因此存在測量偏倚的可能性。(3)對部分少見、罕見的臨床真菌感染病例未能納入?？赡軙藶榈奶岣進(jìn)ALDI-TOF MS對臨床常見真菌鑒定的準(zhǔn)確性。

綜上所述，MALDI-TOF MS對臨床常見真菌鑒定具有較高的準(zhǔn)確性。隨著MALDI-TOF MS鑒定數(shù)據(jù)庫的不斷完善、軟件功能的不斷更新、影響因素的不斷明確，以及對耐藥菌株檢測能力的不斷增強，MALDI-TOF MS 技術(shù)將為臨床真菌的鑒定提供更為方便、快捷、準(zhǔn)確的實驗結(jié)果。