吳歡歡 王偉繼 呂 丁 胡玉龍 孔 杰

應(yīng)用高通量測序技術(shù)分析大菱鲆幼魚腸道及其養(yǎng)殖環(huán)境的微生物群落結(jié)構(gòu)*

吳歡歡1,2王偉繼2呂 丁2胡玉龍2孔 杰1,2①

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306； 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

采用基于Illumina測序平臺的高通量測序技術(shù)，對大菱鲆()幼魚腸道及其養(yǎng)殖水體、生物餌料中細(xì)菌種類及豐度進(jìn)行研究。測序結(jié)果顯示，養(yǎng)殖水體、生物餌料和大菱鲆幼魚腸道等19個樣品共獲得有效序列547621條，可聚類于3771個可分類操作單元(OTUs)，歸屬于養(yǎng)殖水體、生物餌料、健康幼魚和發(fā)病幼魚的操作分類單元(OTU)個數(shù)分別為3038、1090、87和777，其中，健康幼魚與生物餌料、健康幼魚與養(yǎng)殖水體特有的OTU個數(shù)分別為57和0，發(fā)病幼魚與生物餌料、發(fā)病幼魚與養(yǎng)殖水體特有的OTU個數(shù)分別為481和31。表明幼魚腸道微生物多樣性與生物餌料密切相關(guān)。根據(jù)細(xì)菌注釋結(jié)果，擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)在大菱鲆幼魚腸道中占優(yōu)勢地位，其中，健康幼魚腸道微生物共聚類為8個門，發(fā)病幼魚的腸道微生物可聚類為19個門。與健康幼魚相比，發(fā)病幼魚腸道門水平上的3種主要優(yōu)勢菌群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)失衡。此外，對各樣品中豐度最高的100位OTU分析顯示，幼魚腸道優(yōu)勢菌種類與生物餌料中的優(yōu)勢菌種類密切相關(guān)，而每個發(fā)病幼魚腸道優(yōu)勢菌種類具有一定的獨(dú)立性。本研究旨在為大菱鲆健康養(yǎng)殖和微生態(tài)調(diào)控提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

生物多樣性；高通量測序；大菱鲆

大菱鲆()屬于比目魚類，在我國市場上稱為“多寶魚”。野生大菱鲆生活于冰島與摩洛哥附近的歐洲海域(Blanquer, 1992)，是一種具有耐低溫、生長快等特點(diǎn)的大型底棲經(jīng)濟(jì)魚類。近年來，由于缺乏抗病大菱鲆良種選育，腹水癥成為苗種培育期間的多發(fā)病，對大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重影響。腹水癥病原學(xué)的初步研究認(rèn)為，細(xì)菌是導(dǎo)致腹水癥發(fā)生的主要原因(景亞運(yùn)等, 2016)。但多年來，研究人員對大菱鲆腹水癥的致病菌的研究表明，導(dǎo)致大菱鲆發(fā)生腹水癥的致病菌卻不盡相同，如遲緩愛德華氏菌()(李筠等, 2016)、鰻弧菌()(張曉君等, 2006)、燦爛弧菌()(Thomson, 2005)、哈維氏弧菌()(Austin, 2006)和溶藻弧菌()(張偉妮, 2006)等，腹水癥這一特征給該病的診斷和防治造成了困難。有學(xué)者利用限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)研究大菱鲆腸道微生物多樣性(邢孟欣等, 2014)，但這種傳統(tǒng)方法獲得的生物信息較少，具有一定的局限性，只能對少數(shù)主要的優(yōu)勢微生物進(jìn)行分析(王賢豐等, 2017)，難以全面解析微生物的組成結(jié)構(gòu)。

高通量測序技術(shù)是一種能夠?qū)ι习偃f個脫氧核苷酸鏈同時進(jìn)行測序的第2代技術(shù)。目前，基于細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增子測序的高通量測序技術(shù)成為研究樣本生境內(nèi)環(huán)境微生物菌群結(jié)構(gòu)的重要手段，在水環(huán)境(竇妍等, 2016)、土壤(Ligi, 2014; Zhang, 2016)、空氣(李紅梅等, 2015)、口腔(Pozhitkov, 2011)和植物生境(陳澤斌等, 2016)等方向得到了廣泛應(yīng)用，全面解析樣品生境內(nèi)的微生物組成和數(shù)量。

本研究基于Illumina測序平臺的高通量測序技術(shù)對山東某大菱鲆養(yǎng)殖場育苗期的養(yǎng)殖水環(huán)境、蓄水池中自然海水、生物開口餌料和健康與自然患腹水癥的幼魚樣品進(jìn)行研究，分析暴發(fā)腹水癥期間投喂的生物餌料、養(yǎng)殖水體和幼魚腸道的生物環(huán)境內(nèi)的微生物組成及數(shù)量變化，以期更深入了解大菱鲆育苗腸道及養(yǎng)殖環(huán)境群落結(jié)構(gòu)，為大菱鲆健康養(yǎng)殖和微生態(tài)調(diào)控提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于2017年4月下旬在山東某養(yǎng)殖場應(yīng)用工廠化海水半循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)進(jìn)行大菱鲆家系苗種培育。苗種培育初期(5月下旬)育苗車間開始流行腹水癥，期間收集了幼魚(Group_Fish)、生物餌料(Group_ Baits)和養(yǎng)殖水體(Group_Water) 3類樣品。幼魚分為健康幼魚組(Group_E)和發(fā)病幼魚組(Group_F)，每組3尾；生物餌料有來自渤海灣的金海灣小鹵蟲()和無棣小鹵蟲()、來自西藏的大鹵蟲()、輪蟲()、小球藻()和裂壺藻()，每種餌料1個樣品；養(yǎng)殖水體可分為蓄水池自然海水(Group_B)、健康幼魚養(yǎng)殖水體(Group_C)和發(fā)病幼魚養(yǎng)殖水體(Group_D)，其中，自然海水1個，養(yǎng)殖水體各3個。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品收集 生物餌料中收集的鹵蟲和輪蟲均由卵孵化去殼收集得到；小球藻和裂壺藻為公司培養(yǎng)收集得到；水樣是利用隔膜真空泵抽濾2 L水體過0.22 μm孔徑的醋酸纖維濾膜得到的。

1.2.2 DNA的提取 水環(huán)境DNA使用天根土壤DNA提取試劑盒(TIANamp Soil DNA Kit)提取，具體操作參照試劑盒說明書；其余樣品DNA采用酚–氯仿法提取。

1.2.3 高通量測序方法 利用細(xì)菌通用引物343F: 5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'/798R: 5'-CCGTCAATT--CMTTTRAGTTT-3'對細(xì)菌的16S rDNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，送諾和致源生物公司進(jìn)行基于Illumina平臺的高通量測序。

1.2.4 生信分析 對下機(jī)后的原始數(shù)據(jù)(Raw reads)進(jìn)行雙端去雜、拼接和去嵌合體等質(zhì)控處理，獲得優(yōu)質(zhì)的有效序列(Valid tags)。應(yīng)用VSEARCH(v2.4.2)軟件，對Valid tags依照97%的相似度聚類成為可操作分類單元(Operational taxonomic unit, OTU)，而后選取每個歸類單元中豐度最高的序列作為該單元的代表序列(Edgar, 2010)，并與Silva的SSU rRNA數(shù)據(jù)庫序列信息比對，獲得生物注釋。最后對各樣品OTU進(jìn)行豐度、α-多樣性、β-多樣性以及各分類水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較分析，來探究餌料和養(yǎng)殖水體對大菱鲆幼苗生物多樣性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

19個樣品所測的原始序列經(jīng)去雜、拼接等質(zhì)控處理共得Clean tags 722213條，然后再去除嵌合體，共獲得有效序列547621條，占Clean_tags的75.83%；使用VSEARCH (v2.4.2)軟件，對有效序列按照97%的相似度共聚類為3771個OTUs。

生物餌料中海大小鹵蟲(B1)、無棣小鹵蟲(B2)、無棣大鹵蟲(B3)、輪蟲(B4)、小球藻(B5)和裂壺藻(B6)分別獲得的OTU個數(shù)為90、743、50、258、277和111，去重復(fù)后餌料組共得1090個OTUs。水體組共獲得3080個OTUs。其中，自然海水的OTU個數(shù)為2124，3個檢測的健康幼魚養(yǎng)殖水體的OTU個數(shù)分別為1899、1806和1013，去重復(fù)后健康幼魚養(yǎng)殖水體組共獲得2464個OTUs，3個檢測的發(fā)病幼魚養(yǎng)殖水體的OTU個數(shù)分別為520、1374和1320，去重復(fù)后發(fā)病幼魚養(yǎng)殖水體組共獲得1560個OTUs。幼魚組共獲得785個OTUs。其中，3尾健康幼魚的OTU個數(shù)分別為44、51和75，去重復(fù)后健康幼魚組共獲得87個OTUs，3尾發(fā)病幼魚的OTU個數(shù)分別為219、634和41，去重復(fù)后發(fā)病幼魚組共獲得777個OTUs。根據(jù)各樣品OTU信息，對各樣品組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)如表1所示。

表1 各組OTU統(tǒng)計(jì)分析

Tab.1 Statistical analysis of OTUs in different groups

2.2 自然海水組、健康幼魚組、發(fā)病幼魚組和餌料組的OTU Venn圖分析

OTU的數(shù)目可以代表物種的豐富程度(Zhang, 2009)。為探究養(yǎng)殖水體、餌料對幼魚生境內(nèi)生物多樣性的影響程度，對自然海水組、健康幼魚組、發(fā)病幼魚組和餌料組的OTU進(jìn)行Venn圖分析(圖1)。

圖1 各組韋恩圖

Group_B: 自然海水組; Group_E: 健康幼魚組; Group_F: 發(fā)病幼魚組; Group_Baits: 生物餌料組

Group_B: Natural sea water; Group_E: Healthy juvenile fish; Group_F: Diseased juvenile fish; Group_Baits: Living baits

Group_E和Group_F: Group_E(健康幼魚組)和Group_F(發(fā)病幼魚組)的OTU個數(shù)分別為87和777，共有的OTU個數(shù)為79個，分別占各自組OTU數(shù)目的90.80%和10.17%。

Group_Water: 自然海水組(Group_B)的OTU個數(shù)為2124，健康養(yǎng)殖水體組(Group_C)的OTU個數(shù)為2464，發(fā)病養(yǎng)殖水體組(Group_D)的OTU數(shù)有所降低，為1560，Group_Water總OTU數(shù)為3038個。其中，健康養(yǎng)殖水體組(Group_C)與自然海水組(Group_B)共有的OTU數(shù)為1702個，占自然海水組總數(shù)的80.13%；而發(fā)病養(yǎng)殖水體組與自然海水組共有的OTU個數(shù)為681個，占自然海水組OTU總數(shù)的32.06%。

Group_E、Group_B和Group_Baits: 3組共有的OTU數(shù)目為23個。其中，Group_E與Group_Baits共有的OTU數(shù)為80個，特有的OTU數(shù)為57個，分別占Group_E OTU數(shù)的91.95%和65.52%；Group_E與Group_B共有的OTU數(shù)為23個，特有的OTU數(shù)為0，分別占Group_E OTU數(shù)的26.44%和0。

Group_F、Group_B和Group_Baits: 3組共有的OTU數(shù)目為155個。其中，Group_F與Group_Baits共有的OTU數(shù)為636個，特有的OTU為481個，分別占Group_F OTU數(shù)的81.85%和61.90%；Group_F與Group_B共有的OTU數(shù)為186個，特有的OTU為31個，分別占Group_E OTU數(shù)的23.94%和3.99%。

2.3 微生物多樣性分析

2.3.1 生境內(nèi)多樣性(α-Diversity)分析 使用軟件Qiime計(jì)算各樣本均一化處理后OTU數(shù)據(jù)的Goods coverages、Chao1和Simpson指數(shù)(表2)，分別表征數(shù)據(jù)的測序深度、OTU豐富度和群落多樣性。所有樣品的Good’s coverages指數(shù)范圍為0.93~1.00?；贑hao1指數(shù)繪制的稀釋曲線如圖2所示，隨著抽樣數(shù)的增加，各樣品稀釋曲線斜率均逐漸降低，后期曲線趨于平緩，Chao1指數(shù)基本與測序獲得的OTU數(shù)目一致，說明在當(dāng)前的測序深度下，得到的測序數(shù)據(jù)量可以代表樣本中的細(xì)菌信息。Group_Baits、Group_Water和Group_Fish的Simpson指數(shù)分別為0.83±0.094、0.95±0.035和0.82±0.12，利用SPSS 18.0軟件對Simpson指數(shù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，顯示Group_Water的微生物多樣性程度均顯著高于Group_Baits和Group_Fish兩組(<0.05)。

2.3.2 生境間多樣性(β-Diversity)分析 微生物群落聚類分析根據(jù)樣本相似性進(jìn)行非加權(quán)組平均法(Unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA)分析，采用Jackknifed重復(fù)抽樣對UPGMA的可靠性進(jìn)行檢驗(yàn)(圖3)。結(jié)果顯示，75%~ 100%可信度認(rèn)為水體組中的各樣本單獨(dú)聚為一支；50%~75%可信度認(rèn)為餌料組中B2、B4和B5與發(fā)病幼魚組中F15.1和F15.2聚為一支；75%~100%可信度認(rèn)為餌料組中的B1、B3和B6、發(fā)病幼魚組中F15.3與健康幼魚組所有樣品聚為一支。

表2 各樣品α多樣性指數(shù)

Tab.2 α-Diversity indices of each sample

利用主成分分析(PCA, Principal component analysis)對反應(yīng)樣本差異的OTU組成進(jìn)行方差剖分，降維成2個反映方差的2個特征值，并以此作為二維坐標(biāo)PCA圖的橫縱坐標(biāo)，基于Unifrac距離進(jìn)行PCA分析。從圖4可明顯看出，所有樣品大致聚為5簇:餌料與魚體組(Group_Baits、Group_E and Group_F) 2簇，自然海水組(Group_B)、健康養(yǎng)殖水體組(Group_C)、發(fā)病養(yǎng)殖水體組(Group_D)各一簇。Group_Baits、Group_C和Group_D大部分樣品均重疊在一簇。

圖2 基于Chao1指數(shù)的稀釋曲線

B1: 金海灣小魯蟲; B2: 無棣小魯蟲; B3: 西藏大魯蟲; B4: 輪蟲; B5: 小球藻; B6: 裂弧藻; W18: 自然海水; W16: 健康幼魚養(yǎng)殖水體; W17: 發(fā)病幼魚養(yǎng)殖水體; F14: 健康幼魚; F15: 發(fā)病幼魚。同圖3、圖5和圖6

B1:in Jinhaiwan; B2:in Wudi; B3:in Tibet; B4:; B5:; B6:; W18: Sea water; W16: Aquaculture water of healthy juvenile fish; W17: Aquaculture water of diseased juvenile fish; F14: Healthy juvenile fish; F15: Diseased juvenile fish. The same as in Fig.3, Fig.5, and Fig.6

圖3 UPGMA聚類分析及可信度檢驗(yàn)

紅色、黃色、綠色、藍(lán)色分別代表UPGMA分析可信度的75%~100%、50%~75%、25%~50%和25%

Red, yellow, green, and blue represent 75%~100%, 50%~75%, 25%~50%和25% of UPGMA analysis reliability

圖4 主成分分析

Group_B: 自然海水組; Group_C: 健康幼魚養(yǎng)殖水體; Group_D: 發(fā)病幼魚養(yǎng)殖水體; Group_E: 健康幼魚組; Group_F: 發(fā)病幼魚組; Group_Baits: 生物餌料組

Group_B: Natural sea water; Group_C: Sea water of healthy juvenile fish; Group_D: Sea water of diseased juvenile fish; Group_E: Healthy juvenile fish; Group_F: Diseased juvenile fish; Group_Baits: Living baits

2.3.3 門、科、屬三種分類水平下的群落結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)注釋結(jié)果，所有樣本在本次測序中檢測的微生物有細(xì)菌和古細(xì)菌，其中，細(xì)菌歸于37個門、100個綱、225個目、459個科和959個屬。

在門水平上，纖維桿菌門(Fibrobacteres)、迷蹤菌門(Elusimicrobia)、黏膠球菌門(Lentisphaerae)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、Latescibacteria、Cloacimonetes、Aminicenantes、裝甲菌門(Armatimonadetes)、Saccharibacteria、衣原體門(Chlamydiae)、螺旋菌門(Spirochaetae)、Synergistetes、Candidate_division_SR1、Marinimicrobia_(SAR406_ clade)、TM6、PAUC34f、JL_ETNP_Z39、GOUTA4、SHA_109、WCHB1_60和TA06等22個門細(xì)菌含量較低，占比不足細(xì)菌總量的1%；酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠菌門(Chlorobi)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、脫鐵桿菌門(Deferribacter)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、芽孢單菌門(Gemmatimonades)、Gracilibacteria、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、Parcubacteria、浮霉菌門(Planctomycetes)、變形菌門(Proteobacteria)和柔膜菌門(Tenericutes)等15個優(yōu)勢門占細(xì)菌總量的97.09%以上。

15個優(yōu)勢菌門的菌群結(jié)構(gòu)如圖5所示，魚體組中細(xì)菌在門水平上的菌群結(jié)構(gòu)差異不大，占比前3的優(yōu)勢門為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，與餌料生物的門類細(xì)菌組成及其比例較為相似。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，健康幼魚組共檢測出8個門，占比前3的優(yōu)勢菌門比例依次為51.84%±0.63%、26.17%±0.84%和15.11%±0.40%，標(biāo)準(zhǔn)差均小于1%，表明健康幼魚的菌群結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定；發(fā)病幼魚組共檢測到的細(xì)菌門數(shù)為19個，3種優(yōu)勢菌門的比例范圍依次為22.31%~52.31%、18.77%~ 30.53%和14.93%~52.77%，組內(nèi)比例波動較大。

圖5 各樣品門水平下細(xì)菌相對豐度

基于OTU注釋結(jié)果，豐度較高的15個優(yōu)勢菌科分別為弧菌科(Vibrionaceae)、Rhodobacteraceae、假交替單胞菌科(Pseudoalteromonadaceae)、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)、海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)、支原體(Mycoplasmataceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、梭桿菌科(Fusobacteriaceae)、Flavobacteriaceae、科爾韋爾氏菌科(Colwelliaceae)、擬桿菌目某科(Bacteroidales_ S24_7_group)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、交替單胞菌科(Alteromonadaceae)、產(chǎn)堿桿菌科(Alcaligenaceae)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)。菌群結(jié)構(gòu)如圖6所示，15個科包含的細(xì)菌占總細(xì)菌含量的67.95%，樣品間科水平的種類和細(xì)菌量各不相同。健康幼魚組(Group_E)共檢測出7個科，其中，至少在2個重復(fù)樣品都檢測到的科為6個，分別為紫單胞菌科(51.64%± 0.56%)、毛螺菌科(23.82%±1.03%)、產(chǎn)堿桿菌科(12.20%±0.32%)、腸桿菌科(2.89%±0.28%)、擬桿菌科(0.031%±0.019%)和擬桿菌目某科(0.022%±0.0097%)，其6個科的細(xì)菌量占總細(xì)菌量的(90.59%±1.09%)，與餌料組B1、B3和B6的菌群結(jié)構(gòu)較為相似。與健康幼魚組(Group_E)相比，發(fā)病幼魚組(Group_F)組內(nèi)菌屬多樣性和菌群結(jié)構(gòu)差異均較大，F(xiàn)15.3菌群結(jié)構(gòu)與健康幼魚較為相似，而F15.1和F15.2中紫單胞菌科(2.71%±1.89%)、毛螺菌科(7.13%±5.12%)和產(chǎn)堿桿菌科(0.51%±0.10%)的細(xì)菌比重顯著低于健康幼魚組，腸桿菌科(18.81%± 2.41%)、擬桿菌科(11.78%±13.58%)和擬桿菌目某科(13.27%±4.29%)的細(xì)菌比重顯著高于健康幼魚組；除此之外，還有9個科只存在于發(fā)病幼魚組，其中，至少在2個重復(fù)樣品檢測到的科有5個，分別為弧菌科(1.10%±0.11%)、Rhodobacteraceae (0.22%±0.30%)、支原體(0.48%±0.67%)、梭桿菌科(0.05%±0.03%)和Flavobacteriaceae (0.10%±0.13%)。

在屬水平上，19個樣品中細(xì)菌豐度最高的15個屬分別為副桿菌屬()、、、假交替單胞菌屬()、大腸志賀氏桿菌屬()、嗜冷菌屬()、擬桿菌屬()、科爾韋爾氏菌屬()、、、弧菌屬()、短波單胞菌屬()、、冷桿菌屬()、。

15種優(yōu)勢菌屬在各樣品中的菌群分布及結(jié)構(gòu)特征見圖7，健康幼魚組組內(nèi)屬水平菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，含有5個菌屬，分別為副桿菌屬(59.13%±0.77%)、(25.03%±0.84%)、(13.97%±0.21%)、假交替單胞菌屬(1.83%±0.18%)和擬桿菌屬(0.036%±0.022%)。與健康幼魚組相比，發(fā)病幼魚組組內(nèi)菌屬多樣性和菌群結(jié)構(gòu)差異均較大，F(xiàn)15.3菌群結(jié)構(gòu)與健康幼魚較為相似，而F15.1和F15.2中的副桿菌屬(2.57%±1.70%)、(0.88%± 0.42%)和(0.19%±0.12%)的細(xì)菌比重顯著低于健康幼魚組，擬桿菌屬(13.27%±4.29%)和大腸志賀氏桿菌屬(8.50%±2.11%)的細(xì)菌比重顯著低于健康幼魚組，除此之外，還有6個屬只存在于發(fā)病幼魚組，其中，至少在2個重復(fù)樣品都檢測到的屬有4個，分別為弧菌屬(0.31%±0.35%)、短波單胞菌屬(4.25%±5.97%)、Olleya(0.03%±0.04%)和冷桿菌屬(0.01%±0.01%)。

圖6 各樣品科水平下細(xì)菌相對豐度

圖7 各樣品屬水平下細(xì)菌相對豐度

2.3.4 豐度Top100的微生物的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

對OTU的豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，選出豐度最高的100個OTU構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并以熱圖形式展示OTU在不同樣品中的分布(圖8)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，這100條reads共歸于 6個門: 變形菌門(63.54%)、擬桿菌門(21.88%)、厚壁菌門(8.33%)、梭桿菌門(1.56%)、藍(lán)細(xì)菌門(1.56%)和Gracilibacteria(3.13%)。由圖8可知，編號為F14.1、F14.2和F14.3的健康幼魚和編號為F15.3的發(fā)病幼魚與餌料組所屬的金海灣小鹵蟲(B1)、西藏大鹵蟲(B3)和裂壺藻(B6)的高豐度OTU一致，主要為副桿菌屬()、屬、布勞特氏菌屬()、屬、梭菌目(Clostridiales)和奇異變形桿菌()等細(xì)菌。

編號為F15.1和F15.2的2條病魚與生物餌料中無棣小鹵蟲(B2)、輪蟲(B4)和小球藻(B5)中的高豐度OTU一致，主要為擬桿菌屬()、擬桿菌目某科(Bacteroidales_S24_7_group)、腸球菌屬()、約氏乳桿菌()、蒼白桿菌屬()、短波單胞菌屬()、幽門螺桿菌()、腸桿菌屬()、大腸志賀氏桿菌屬()和奇異變形桿菌。

3 討論

本研究利用Illumina Miseq平臺對山東某育苗場暴發(fā)腹水癥的30日齡大菱鲆幼苗及同期健康的幼苗、自然海水、養(yǎng)殖水體和生物餌料等共計(jì)19個樣品內(nèi)的細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行了高通量測序，所有樣品OTU的Good’s coverages指數(shù)范圍在0.93~1.00之間，說明測序深度足夠大，數(shù)據(jù)可以全面解讀各樣品中細(xì)菌的組成及豐度，可以反映絕大多數(shù)的微生物信息。

對Simpson指數(shù)的計(jì)算可知，幼魚、生物餌料和養(yǎng)殖水體的細(xì)菌豐度和多樣性依次升高。有關(guān)半滑舌鰨()(張正等, 2015)和凡納濱對蝦()(孫振麗等, 2016)的研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，即養(yǎng)殖水體的微生物多樣性比動物的腸道微生物多樣性高。健康幼魚和發(fā)病幼魚共有的OTU分別占各自O(shè)TU總數(shù)的90.80%和10.17%。這說明健康的大菱鲆和發(fā)生腹水的大菱鲆腸道細(xì)菌多樣性存在較大的差異，發(fā)病幼魚會受到外界細(xì)菌的侵襲。為了溯源大菱鲆幼魚腸道微生物，基于OTU對生物餌料、自然海水、健康幼魚和發(fā)病幼魚進(jìn)行Venn圖分析(圖1)，顯示健康幼魚和發(fā)病幼魚分別與生物餌料共有的OTU個數(shù)為80和636，分別占幼魚OTU總數(shù)的91.95%和81.85%。有研究認(rèn)為，養(yǎng)殖環(huán)境中的微生物能夠影響?zhàn)B殖動物腸道內(nèi)的微生物多樣性(Li, 2012)，豐度較低的某些細(xì)菌會定植到魚體腸道(Navarrete, 2009)。由此可知，水體的微生物多樣性非常高，自然海水OUT的數(shù)目達(dá)到2124個，但其與健康幼魚特有的OTU數(shù)為0，即使是與發(fā)病幼魚特有的OTU數(shù)也僅為31。由此推測，在大菱鲆腸道微生物群落結(jié)構(gòu)形成初期，生物餌料發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。根據(jù)OTU注釋結(jié)果，健康幼魚的腸道微生物共聚類為8個門，發(fā)病幼魚的腸道微生物可聚類為19個門。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，發(fā)病幼魚組增加的11個門類細(xì)菌豐度均較小，細(xì)菌總量僅占3.91%±2.57%，如酸桿菌門、放線菌門、藍(lán)藻門、Saccharibacteria門和螺旋藻門等。說明當(dāng)幼魚發(fā)病時，餌料中某些豐度較低的細(xì)菌會趁機(jī)植入腸道。

圖8 基于豐度最高的100個OTU的系統(tǒng)進(jìn)化樹及其在各樣品中的分布熱圖

B1: 金海灣小魯蟲; B2: 無棣小魯蟲; B3: 西藏大魯蟲; B4: 輪蟲; B5: 小球藻; B6: 裂弧藻; W18: 自然海水; W16: 健康幼魚養(yǎng)殖水體; W17: 發(fā)病幼魚養(yǎng)殖水體; F14: 健康幼魚; F15: 發(fā)病幼魚

B1:in Jinhaiwan; B2:in Wudi; B3:in Tibet; B4:; B5:; B6:; W18: Sea water; W16: Aquaculture water of healthy juvenile fish; W17: Aquaculture water of diseased juvenile fish; F14: Healthy juvenile fish; F15: Diseased juvenile fish

根據(jù)細(xì)菌分類結(jié)果，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門在大菱鲆幼魚腸道中占優(yōu)勢地位。有學(xué)者研究了體長6 cm大菱鲆幼魚(朱鵬飛, 2015)和體重700 g大菱鲆成魚(邢孟欣等, 2014)的腸道菌群，顯示變形菌門細(xì)菌是豐度最高的門類。而本研究對30日齡(體長為1 cm)健康幼魚的腸道菌群研究結(jié)果顯示，擬桿菌門是主要優(yōu)勢菌門，占細(xì)菌總量的50%以上；其中，變形菌門細(xì)菌僅占15.11%±0.40%。值得注意的是，與健康幼魚相比，發(fā)病幼魚中變形菌門的細(xì)菌豐度明顯提高(30.56%±19.76%)。變形菌門因其細(xì)菌形態(tài)多樣而得名，是細(xì)菌中最大的一個門，主要包括α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱、δ-變形菌綱和ε-變形菌綱，近年又確立一個ζ-變形菌綱(Emerson, 2007)。本研究發(fā)現(xiàn)，β-變形菌綱、伯克氏菌目、產(chǎn)堿桿菌科、屬中的4種未知菌種廣泛存在于健康大菱鲆幼苗體內(nèi)，該屬reads總數(shù)為12471條，占健康幼魚體內(nèi)變形菌綱細(xì)菌總量的80.79%。屬細(xì)菌首次是從健康的人類糞便中分離出來(Nagai, 2009)。屬的細(xì)菌是否參與大菱鲆幼苗正常的腸道代謝活動，還有待進(jìn)一步研究。與健康幼魚相比，發(fā)病幼魚β-變形菌綱占比明顯降低，僅占33.62%。

γ-變形菌綱是目前已知細(xì)菌種類最多的一個綱，包含許多能引起人類致病的細(xì)菌，如沙門氏菌屬()能造成人類傷寒和腸炎。注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)，健康幼魚腸道含有的γ-變形菌綱的細(xì)菌較為單一，全部屬于腸桿菌目腸桿菌科，占健康幼魚變形菌綱細(xì)菌總數(shù)的19.12%；而發(fā)病幼魚腸道中γ-變形菌綱的細(xì)菌較為多樣，主要有腸桿菌目、交替單胞菌目(Alteromonadales)、Cellvibrionales目、著色菌目(Chromatiales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、咸水球星菌目(Salinisphaerales)、硫發(fā)菌目(Thiotrichales)、弧菌目(Vibrionales)和黃色單胞菌目(Xanthomonadales)等，細(xì)菌豐度顯著提高，占發(fā)病幼魚變形菌綱細(xì)菌總數(shù)的51.19%。其中，腸桿菌科、假交替單胞菌目和弧菌目含有許多的致病菌。

對所有樣品(餌料、水體和幼魚)中豐度較高的100個OTU進(jìn)行進(jìn)化樹–熱圖分析發(fā)現(xiàn)(圖8)，健康幼魚腸道中高豐度菌屬在餌料中的產(chǎn)自渤海的金海灣小鹵蟲、產(chǎn)自西藏的大鹵蟲和裂壺藻中中含量頗豐。這些菌屬中大多屬于環(huán)境或動物腸道正常菌群，除了少量奇異變形桿菌。奇異變形桿菌屬于腸桿菌科，是一種條件致病菌，能引起大黃魚()體表潰爛(張慶華等, 2005)、棘胸蛙()爛皮病(王瑞君等, 2012)和中華鱉()腮腺炎病(林亞歌等, 2104)等多種水產(chǎn)動物疾病。從圖8也可看出，該菌在發(fā)病幼魚生境內(nèi)檢測量有所提高。其次，發(fā)病幼魚生境內(nèi)高豐度菌屬在餌料中的產(chǎn)自渤海的無棣小鹵蟲、輪蟲和小球藻中頗豐。這些菌屬中除了環(huán)境中廣泛存在的化能自養(yǎng)類細(xì)菌和奇異變形桿菌外，還有一種致病菌屬——大腸志賀氏桿菌屬。大腸志賀氏桿菌屬是一種腸道感染致病菌(劉蔚等, 1999)，能引起人類痢疾(劉漢明, 1991)。而3種商品化鹵蟲和裂壺藻中大腸志賀氏桿菌屬和奇異變形桿菌的含量都極其豐富。在生產(chǎn)上，鹵蟲需要攝食裂壺藻進(jìn)行營養(yǎng)強(qiáng)化，然后才作為餌料投喂幼魚，而裂壺藻和3種鹵蟲在門水平的菌群結(jié)構(gòu)均較為相似，故推測魚體內(nèi)的大腸志賀氏桿菌屬和奇異變形桿菌均來自裂壺藻。從細(xì)菌進(jìn)化地位來說，大腸志賀氏桿菌屬、奇異變形桿菌與遲緩愛德華氏菌同屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，而腸桿菌科除菊花歐文氏菌都含有腸桿菌科共同抗原(何曉青, 1980)。由此可知，發(fā)病大菱鲆幼魚腸道除了增加許多的有害菌群外，其腸道含量較低的致病菌也存在豐度升高現(xiàn)象。

4 小結(jié)

本研究利用高通量測序技術(shù)對暴發(fā)腹水癥的大菱鲆幼苗及其養(yǎng)殖環(huán)境的微生物多樣性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，生物餌料中的微生物參與大菱鲆幼魚腸道早期菌群的形成，并起主要作用，也會引起發(fā)病幼魚腸道有害菌群大量滋生。因此，為了有效預(yù)防大菱鲆幼魚疾病的暴發(fā)，在育苗過程中，應(yīng)規(guī)范養(yǎng)殖，減少應(yīng)激，并加強(qiáng)開口餌料中病原菌的檢查及防控力度。

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Turbot () Biodiversity Assessment Using High-Throughput Illumina Sequencing to Analyze Juvenile Turbot Intestines and Their Bacterial Cultures

WU Huanhuan1,2, WANG Weiji2, Lü Ding2, HU Yulong2, KONG Jie1,2①

(1. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education; College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071)

In order to study the effects of environmental factors on the intestinal flora structure of turbot (), we used high-throughput sequencing to explore the bacterial community structure and diversity in juvenile turbot intestines, the culture environment, and biological baits. The results showed that 547621 effective sequences were detected in nineteen samples, and they could be classified into 3771 operational taxonomic units (OTUs), among which 3038, 1090, 87, and 777 originated from the aquaculture water, the biological baits, healthy juvenile turbot intestine, and diseased juvenile fish intestine, respectively. There were 57 OTUs shared between the healthy juvenile turbot intestine and the biological baits, 0 OTU shared between the healthy juvenile turbot intestine and aquaculture water, 481 OTUs shared between the diseased juvenile fish intestine and the biological baits, 31 OTUs shared between the diseased juvenile fish intestine and the aquaculture water. The effect of biological bait on microbial diversity of intestinal tract of juvenile fish was much greater than that of environment. In total, the predominant phyla in the turbot intestine were Bacteroidetes, Firmicutes, and Proteobacteria. The intestinal microflora of healthy juvenile turbot can be clustered into 8 phyla, and the intestinal microflora of the diseased juvenile fish could be clustered into 19 phyla. Compared with the healthy juveniles, the community structure of the predominant phyla was imbalanced at the intestinal level of the diseased juvenile fish. Furthermore, analysis of the 100 most abundant bacterial OTUs in the different samples revealed that the species dominant in the intestinal bacteria of juvenile fish was closely related to the dominant species in the biological baits. Meanwhile, the intestinal dominant bacteria species of each diseased juvenile are different. This study provided the basis for healthy culture and micro-ecological regulation of turbot.

Biodiversity; High throughput sequencing; Turbot ()

KONG Jie, E-mail: kongjie@ysfri.ac.cn

S968

A

2095-9869(2019)04-0084-11

10.19663/j.issn2095-9869.20180507003

* 山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目“泰山學(xué)者種業(yè)計(jì)劃專家項(xiàng)目”(ZR2014CQ001)和山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目“大菱鲆種質(zhì)資源精準(zhǔn)鑒定與選種育種創(chuàng)新利用-子課題”(2016LZGC031-2)共同資助 [This work was supported by Taishan Scholar Program for Seed Industry (ZR2014CQ001), and Accurate Identification and Selection Breeding Creative Utilization of Turbot Germplasm Resources (2016LZGC031-2)]. 吳歡歡，E-mail: 17664080328@163.com

孔 杰，研究員，E-mail: kongjie@ysfri.ac.cn

2018-05-07,

2018-07-09

吳歡歡, 王偉繼, 呂丁, 胡玉龍, 孔杰. 應(yīng)用高通量測序技術(shù)分析大菱鲆幼魚腸道及其養(yǎng)殖環(huán)境的微生物群落結(jié)構(gòu). 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2019, 40(4): 84–94

Wu HH, Wang WJ, Lü D, Hu YL, Kong J. Turbot () biodiversity assessment using high-throughput Illumina sequencing to analyze juvenile turbot intestines and their bacterial cultures. Progress in Fishery Sciences, 2019, 40(4): 84–94

(編輯 馮小花)