亐開(kāi)興， 王凱悅， 張繼才， 黃必志， 陳寧博， 馮光杰， 李順東， 陳 宏， 雷初朝*

(1.云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院，昆明 650212；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.云南谷多農(nóng)牧業(yè)有限公司，云南 廣南 663300)

文山牛又名文山高峰牛，屬役肉兼用型地方黃牛品種，主要分布于云南省文山壯族苗族自治州的文山、硯山、西疇、麻栗坡、馬關(guān)、丘北、廣南、富寧八縣，其中廣南、富寧、丘北、硯山等縣海拔900 m以上、旱地面積較大的地區(qū)分布較多，以廣南、富寧兩縣結(jié)合部的百樂(lè)—坡油一帶的文山牛最為出名[1]。文山牛體軀結(jié)實(shí)勻稱，力大耐勞，繁殖力較強(qiáng)，性情溫順，能適應(yīng)干燥寒冷和潮濕炎熱的氣候，是一個(gè)優(yōu)良的役用地方黃牛品種，并具有較好的肉用性能[2]。

Y染色體單倍型頻率和地理分布可以提供有關(guān)遷徙、雄性基因流以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等信息[3]，因此，Y染色體特異性標(biāo)記已被廣泛用于研究人類與動(dòng)物的父系起源。近年來(lái)，基于Y染色體單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(Y—SNPs)研究結(jié)果，定義了普通牛Y1、Y2和瘤牛Y3單倍型組，以及一個(gè)新的Y1.2單倍型組[4-6]。常振華等[7]利用Y—SNP標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)中國(guó)黃牛以Y2和Y3單倍型組為主，Y2單倍型組在北方牛群體中占優(yōu)勢(shì)，Y3單倍型組在南方牛群體中占優(yōu)勢(shì)。而關(guān)于家牛Y染色體STR變異研究，Edwards等[8]首先評(píng)估了4個(gè)Y-STR特異性標(biāo)記在家牛以及相關(guān)物種中的遺傳多態(tài)性。隨后，Cai等[9]研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)Y—STR位點(diǎn)(UMN2404和UMN0103)可用于區(qū)分普通牛和瘤牛血統(tǒng)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的研究已經(jīng)將二者結(jié)合起來(lái)分析黃牛群體的Y染色體單倍型結(jié)構(gòu)和父系起源歷史[10-11]。Xia等[12]分析了34個(gè)中國(guó)黃牛品種/群體的Y—SNPs和Y—STRs多態(tài)性，結(jié)果表明中國(guó)黃牛存在豐富的父系遺傳多樣性，并且可能擁有許多起源于近東馴化中心的原牛血統(tǒng)。

我國(guó)幅員遼闊，自然環(huán)境復(fù)雜多樣，孕育了十分豐富的黃牛遺傳資源，到目前為止，大多數(shù)關(guān)于文山牛品種遺傳多樣性的研究主要集中于線粒體水平。文際坤等[13]通過(guò)分析線粒體DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(mtDNA RFLP)，表明文山牛同時(shí)具有普通牛和瘤牛母系起源，以瘤牛血統(tǒng)為主。隨后，錢林東等[14]測(cè)定了文山牛mtDNA D—loop區(qū)全序列并對(duì)其群體遺傳變異進(jìn)行分析，結(jié)果同樣支持云南文山牛具有普通牛和瘤牛兩種母系血統(tǒng)來(lái)源。然而，關(guān)于文山牛Y染色體遺傳多樣性及父系起源的研究較少。Gou等[15]通過(guò)比較文山牛的線粒體控制區(qū)和Y染色體基因片段，線粒體數(shù)據(jù)表明，文山牛存在普通牛和瘤牛兩種母系起源，以瘤牛血統(tǒng)為主；而Y染色體系統(tǒng)發(fā)育表明，文山牛的父系起源幾乎都是瘤牛。此外，Xia等[12]利用Y-SNPs結(jié)合Y-STRs的單倍型分型方法，對(duì)20頭文山牛的父系起源進(jìn)行了調(diào)查，表明文山牛含有Y2和Y3兩種父系起源。但之前的研究用到的樣本量較少，對(duì)文山牛群體的代表性較低。因此，本研究利用Y-SNPs(UTY19和ZFY10)和Y-STRs(INRA189和BM861)標(biāo)記，對(duì)55頭文山牛進(jìn)行單倍型分析和父系起源研究，為加強(qiáng)云南文山牛種質(zhì)資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與基因組DNA提取

在云南谷多農(nóng)牧業(yè)有限公司那朵牧場(chǎng)采集55頭文山牛公牛的耳組織樣帶回實(shí)驗(yàn)室，采用苯酚—氯仿方法[16]提取全基因組DNA，提取的基因組DNA

放在-20 ℃保存?zhèn)溆?。用本?shí)驗(yàn)室保存的5頭荷斯坦牛公牛DNA做對(duì)照。

1.2 引物合成與PCR擴(kuò)增

參照G?therstr?m等[5]和Ginja等[16]報(bào)道的2個(gè)家牛Y-SNP標(biāo)記(UTY19和ZFY10)引物序列信息合成引物(表1)，參照Edwards等[10]發(fā)表的2對(duì)Y-STR標(biāo)記(INRA189和BM861)引物序列信息合成引物(表2)。

PCR反應(yīng)體系為12.5 μL：ddH2O 5.00 μL，2×Taq MasterMix 6.00 μL，上下游引物各0.25 μL(10 pmol/μL)，模板DNA 1.00 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見(jiàn)表1和表2)，72 ℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用2%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，將檢測(cè)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序與分型。

表1 2對(duì)Y-SNP引物信息

表2 2對(duì)Y-STR引物信息

2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)合已經(jīng)發(fā)表的家牛序列(GenBank登錄號(hào)分別為AY936543和AF928827)，將UTY19和ZFY10測(cè)序結(jié)果用SeqMan v7.1軟件進(jìn)行比對(duì)分析，找出相應(yīng)的SNP位點(diǎn)。用GeneMarker V1.91軟件對(duì)熒光微衛(wèi)星標(biāo)記INRA189和INRA189的等位基因大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。由于不同酶對(duì)微衛(wèi)星結(jié)果會(huì)產(chǎn)生1～2 bp的影響，所以本研究同時(shí)使用荷斯坦牛微衛(wèi)星數(shù)據(jù)做校正，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。每個(gè)個(gè)體的單倍型都是利用Y-SNPs先確定家牛的單倍型組，繼而結(jié)合Y-STRs分型，二者共同確定出每頭牛的Y染色體單倍型(Y—SNP—INRA189-BM861)。用Arlequin V3.11軟件計(jì)算單倍型頻率和單倍型多樣度(H±SD)。

3 結(jié)果與分析

3.1 文山牛Y—SNPs多態(tài)性

將55頭文山牛2個(gè)Y—SNPs標(biāo)記(UTY19和ZFY10)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果，與G?therstr?m等[5]和Ginja等[4]報(bào)道的家牛序列(GenBank登錄號(hào)：AY936543和AF928827)進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明：2個(gè)Y—SNPs標(biāo)記在55頭文山牛中均不具有多態(tài)性。與標(biāo)準(zhǔn)序列相比，UTY19標(biāo)記全部為C>A核苷酸顛換，而ZFY10標(biāo)記全部為C>T核苷酸轉(zhuǎn)換。參考 G?therstr?m等[5]和Ginja等[4]對(duì)家牛Y染色體單倍型組的判定標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)2個(gè)標(biāo)記的核苷酸變異確定單倍型組，結(jié)果顯示，55頭云南文山牛均為Y3單倍型組，對(duì)照組荷斯坦牛均為Y1單倍型組。

3.2 文山牛Y—STRs多態(tài)性

利用2個(gè)Y—STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)，對(duì)55頭文山牛Y染色體多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。在INRA189座位中共檢測(cè)到88 bp和90 bp兩個(gè)等位基因，所占個(gè)體數(shù)分別為49頭和6頭，均對(duì)應(yīng)瘤牛Y3單倍型組；在BM861座位中僅檢測(cè)到一種等位基因(156 bp)，對(duì)應(yīng)瘤牛Y3單倍型組。對(duì)照組荷斯坦牛在INRA189座位中為98 bp等位基因，在BM861座位中僅檢測(cè)到一種等位基因(158 bp)。

3.3 文山牛Y染色體單倍型頻率和單倍型多樣度

參照Edwards等[10]報(bào)道的Y—SNPs和Y—STRs標(biāo)記結(jié)合的單倍型分型方法，對(duì)55頭文山牛的單倍型(Y—SNP—INRA189—BM861)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)55頭文山牛均為Y3單倍型組，但有2種單倍型Y3—88—156和Y3—90—156，其中Y3—90—156單倍型頻率為0.09，Y3—88—156單倍型頻率為0.91，文山牛Y染色體單倍型多樣度為0.1684±0.0636；所有的荷斯坦公牛對(duì)照組都是Y1-98-158單倍型。

4 討 論

本研究旨在全面了解南方黃牛文山牛品種中Y染色體的遺傳多樣性，并提供父系起源和群體結(jié)構(gòu)的分子證據(jù)。G?therstr?m等[5]首次從180個(gè)現(xiàn)代家牛樣本Y染色體基因中(DBY、UBE1Y、UTY19和ZFY10)找到了Y—SNP標(biāo)記，成功區(qū)分出家牛的3種Y染色體單倍型組，即普通牛Y1、Y2和瘤牛Y3單倍型組。隨后不斷有報(bào)道驗(yàn)證了Y—SNP標(biāo)記在研究家牛父系起源的重要作用[7,10,12]。相比Y—SNP標(biāo)記，Y—STR標(biāo)記具有突變率高、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)。Edwards等[8]利用不同牛種對(duì)4個(gè)牛Y—STR標(biāo)記(INRA126、INRA124、INRA189和BM861)的特異性進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，INRA124、INRA189和BM861標(biāo)記在家牛中均展現(xiàn)出普通牛和瘤牛的特異性。INRA189和BM861標(biāo)記作為2個(gè)經(jīng)典標(biāo)記，在本研究中只有INRA189表現(xiàn)出多態(tài)性。

Li等[11]對(duì)中國(guó)16個(gè)地方黃牛品種Y—SNP和Y—STR進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)中國(guó)黃牛有普通牛和瘤牛兩種父系起源，其中，北方黃牛以普通牛Y2為主，南方黃牛以瘤牛Y3為主。利用Y—SNPs和Y—STRs標(biāo)記，李芳玉等[17]、侯佳雯等[18]分別對(duì)大別山牛和皖南牛的遺傳多樣性和父系起源進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)大別山牛和皖南牛這兩種南方黃牛均以瘤牛為主要的父系起源。然而，大多數(shù)關(guān)于文山牛品種遺傳多樣性的研究主要集中于線粒體DNA。不同于線粒體DNA和常染色體DNA的遺傳特征，Y染色體分子遺傳標(biāo)記反映了動(dòng)物父系遺傳特征，提供父系起源證據(jù)[19]。本研究采用Y—SNPs和Y—STRs相結(jié)合的單倍型分型方法(Y—SNP—INRA189—BM861)，對(duì)55頭文山公牛進(jìn)行了單倍型分析，定義出文山牛2種Y染色體單倍型(Y3—88—156和Y3—90—156)，其中Y3—88—156單倍型占明顯優(yōu)勢(shì)(0.91)，這說(shuō)明文山牛具有與中國(guó)南方黃牛相似的血統(tǒng)來(lái)源，即以Y3—88—156瘤牛單倍型為主[12]。結(jié)果表明，文山牛只有瘤牛父系起源，這與Gou等[15]認(rèn)為文山牛父系起源幾乎均為瘤牛研究結(jié)果相吻合。此外，也與最近Xia等[12]報(bào)道的對(duì)文山牛研究結(jié)果一致，20頭文山牛存在Y2—102—158和Y3—88—156兩種單倍型，其單倍型頻率分別為0.05和0.95。

單倍型多樣度是衡量一個(gè)群體變異程度的重要指標(biāo)，單倍型多樣度高的群體說(shuō)明其遺傳多樣性高，遺傳資源豐富。Edwards等[10]報(bào)道138個(gè)國(guó)外牛品種的單倍型多樣度平均值為0.422±0.269，Li等[11]研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)16個(gè)中國(guó)黃牛品種的單倍型多樣度平均值為0.2258±0.0882，Xia等[12]研究發(fā)現(xiàn)34個(gè)中國(guó)黃牛品種的平均單倍型多樣度為0.607±0.016，均大于本研究調(diào)查的文山牛單倍型多樣度(0.1684±0.0636)，然而本研究結(jié)果和Xia等[12]研究發(fā)現(xiàn)文山牛單倍型多樣度(0.100±0.088)接近，這表明文山牛的分子遺傳多樣性較低，可能與采樣地區(qū)的公牛有效群體較小有關(guān)；另一方面，也說(shuō)明文山牛父系種質(zhì)資源比較純正，遺傳穩(wěn)定，純合度高。