石先華， 王之保， 柏中峰， 孫昊堃, 柏中林， 李 靜， 孫炳燕

(1.泌陽(yáng)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 泌陽(yáng) 463700;2.泌陽(yáng)縣夏南牛研究推廣中心，河南 泌陽(yáng) 463700；3.泌陽(yáng)縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 泌陽(yáng) 463700)

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)牛來(lái)自泌陽(yáng)縣新鑫農(nóng)民專業(yè)合作社飼養(yǎng)的夏南牛母牛和犢牛，懷孕母牛25頭和其對(duì)應(yīng)出生的犢牛25頭，母牛在免疫后15～21 d采集血樣。疫苗使用的是國(guó)家招標(biāo)采購(gòu)的口蹄疫O型、A型雙價(jià)滅活疫苗，每頭母牛注射4 mL，肌肉注射。

采血器材：采樣箱、真空采血管、試管架、一次性離心管、5 mL注射器、酒精棉球、干棉球、記號(hào)筆、牛鼻鉗或繩子、不干膠標(biāo)簽、簽字筆、采樣單、乳膠手套、一次性鞋帽、口罩、一次性防護(hù)服等。

檢測(cè)試劑與設(shè)備：口蹄疫O型抗體檢測(cè)LB-ELISA試劑盒(新模式,生產(chǎn)批號(hào)：E170604，生產(chǎn)日期：2017-06-27)；口蹄疫A型抗體檢測(cè)LB-ELISA試劑盒(新模式、生產(chǎn)批號(hào)：E170703，生產(chǎn)日期：2017-07-27)；試劑盒生產(chǎn)廠家：洛陽(yáng)萊普生信息科技有限公司。檢測(cè)儀器：美國(guó)伯騰全自動(dòng)酶標(biāo)儀，型號(hào)ELX-800。

1.2 方 法

1.2.1 牛源準(zhǔn)備 對(duì)被選母牛在產(chǎn)前1個(gè)月左右加強(qiáng)免疫口蹄疫O型、A型雙價(jià)滅活疫苗1次。母牛產(chǎn)后采血5 mL，檢測(cè)口蹄疫抗體效價(jià)；犢牛出生后的第1天采集血樣，以后每間隔1周采集1次血樣，根據(jù)抗體衰減變化確定下次采血時(shí)間。當(dāng)O型、A型抗體效價(jià)<(1∶64)時(shí)，視為抗體水平不合格，停止采血。

1.2.2 血樣制備 母牛采用尾靜脈采血：采血時(shí)先將5 mL注射器的針頭換用9號(hào)針頭備用固定牛，使牛尾向上翹。在離尾根10 cm左右中點(diǎn)凹陷處，先用酒精棉球消毒，然后用換好的注射器垂直刺入約1 cm深，針頭觸及尾骨后退出1 mm進(jìn)行抽血，每頭牛不少于3 mL。采血結(jié)束，消毒并用棉球按壓止血。

犢牛采用頸靜脈采血：將犢牛保定好，使其頭部稍前伸，并稍偏向?qū)?cè)，對(duì)頸靜脈局部進(jìn)行剪毛、消毒，看清頸靜脈后，采血者用左手拇指或食指與中指，在采血部位稍下方，壓迫靜脈血管、使之充盈、怒張。如果不剪毛時(shí)用手觸摸，感覺(jué)圓滑、有彈性即是血管，另一手執(zhí)采血針頭，與皮膚成45°角。由下方向上方用力刺入皮膚與血管內(nèi)，見(jiàn)有血液流出后即可采集血樣，每頭牛不少于3 mL。采血結(jié)束，消毒并用棉球按壓止血。當(dāng)使用真空血管采血失敗時(shí)，使用5 mL塑料注射器采血。

分離血清：將采集的牛全血傾斜45°角，放置室溫靜止1 h后，以4 000 r/min離心全血5 min，取上清液，并用記號(hào)筆對(duì)每份樣品進(jìn)行標(biāo)記，備用待檢。

1.2.3 檢測(cè)方法 采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18935—2003中的液相阻斷ELISA檢測(cè)方法，對(duì)制備的牛血清樣品進(jìn)行O型、A型口蹄疫抗體檢測(cè)。

1.2.4 判定標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)抗體試劑盒說(shuō)明書(shū)的判定標(biāo)準(zhǔn)：病毒抗原對(duì)照4孔，去掉最高和最低OD值，計(jì)算剩余兩孔的平均值OD值，再除以2，即得50%對(duì)照值，該值為臨界值，表示阻斷50%反應(yīng)的對(duì)照OD值。待檢樣品OD值>臨界值，判為陰性；待檢樣品OD值≤臨界值，判為陽(yáng)性。O型口蹄疫抗體效價(jià)≥(1∶128)，判為陽(yáng)性；抗體效價(jià)≤(1∶64)，判為陰性；抗體效價(jià)在(1∶64)～(1∶128)時(shí)判為可疑。可疑樣品需復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)抗體效價(jià)≥(1∶128)，判為陽(yáng)性，抗體效價(jià)<(1∶128)判為陰性。ELISA抗體效價(jià)與免疫動(dòng)物攻毒保護(hù)關(guān)系：牛、羊抗體效價(jià)≥(1∶128)，99%以上保護(hù)；抗體效價(jià)在(1∶22)～(1∶90)之間，50%保護(hù)；抗體效價(jià)≤(1∶16)，不保護(hù)。A型口蹄疫試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)同O型口蹄疫檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

依據(jù)《2017年河南省動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》(豫牧醫(yī)[2017]22號(hào))文件，口蹄疫血清學(xué)監(jiān)測(cè)、用液相阻斷ELISA試驗(yàn)抗體效價(jià)≥(1∶64)，判為抗體合格；抗體效價(jià)<(1∶64)，判為抗體不合格。存欄家畜的抗體合格率≥70%時(shí)判定為群體免疫合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)結(jié)果

從表1看出，從檢測(cè)的25頭份母牛血樣中，在試驗(yàn)條件下母牛產(chǎn)后O型抗體效價(jià)合格率達(dá)100%，A型抗體效價(jià)合格率達(dá)92%。

表1 母牛口蹄疫O型、A型抗體檢測(cè)結(jié)果分析

從表2及犢牛O型、A型口蹄疫母源抗體衰減變化(圖1)可以看出，25頭犢牛從出生第1天開(kāi)始對(duì)其采血，以后每間隔1周采血1次對(duì)抗體進(jìn)行檢測(cè)，各檢測(cè)了156份次。O型口蹄疫第4周抗體合格率達(dá)86.96%，第5周、第6周抗體合格率逐步降低至66.67%，31.25%，依據(jù)(豫牧醫(yī)[2017]22號(hào))文件規(guī)定的抗體效價(jià)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，已是群體免疫不合格。

A型口蹄疫第3周時(shí)抗體合格率達(dá)75%，第4周降低至39.13%，第5周抗體合格率已為0。依據(jù)(豫牧醫(yī)[2017]22號(hào))文件，第4周時(shí)已是群體免疫不合格。

表2 犢?？谔阋逴型、A型抗體檢測(cè)結(jié)果分析

圖1 犢牛O型、A型口蹄疫母源抗體衰減變化

2.2 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明：犢牛O型口蹄疫獲得母源抗體4周內(nèi)有較強(qiáng)的保護(hù)作用，A型3周內(nèi)有較強(qiáng)的保護(hù)作用。犢牛出生后第1天采血抗體效價(jià)與母牛產(chǎn)后抗體效價(jià)基本一致，口蹄疫O型抗體效價(jià)衰減時(shí)間稍長(zhǎng)于A型。

2.3 討 論

本次試驗(yàn)由于樣品數(shù)量較少，且局限于1個(gè)規(guī)模養(yǎng)牛場(chǎng)，同時(shí)犢牛出生時(shí)間也不一致，可能影響檢測(cè)結(jié)果。本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)也可能不具有普遍性。

抗體衰減變化過(guò)快，原因有待進(jìn)一步探討。從圖1可以看出，O型口蹄疫第4周、第5周、第6周抗體合格率分別為86.96%，66.67%，31.25%，每周降幅依次為20.29和35.42個(gè)百分點(diǎn)，尤其是第5周至第6周7 d之內(nèi)抗體效價(jià)由6頭不合格降至11頭不合格。A型口蹄疫第3周時(shí)抗體合格率達(dá)75%，至第4周時(shí)突然降低至39.13%，第5周時(shí)降為0，衰減速度過(guò)快。分析原因有可能是采樣和檢測(cè)原因，也有可能是犢牛個(gè)體差異原因，具體是何種原因還有待進(jìn)一步探討。

犢牛何時(shí)首免為宜，要因場(chǎng)、因勢(shì)而定。據(jù)劉賀報(bào)道：犢牛O型口蹄疫80日齡首免為宜[1]。根據(jù)筆者的試驗(yàn)，夏南牛犢牛口蹄疫首免時(shí)間在40日齡左右為宜，最長(zhǎng)不宜超過(guò)60日齡。犢牛何時(shí)首免口蹄疫疫苗，各養(yǎng)殖場(chǎng)戶要根據(jù)具體情況而定：首先要考慮母牛的免疫時(shí)間；其次要考慮犢牛的個(gè)體差異和體質(zhì)狀況，最關(guān)鍵的是免疫之前一定要對(duì)群體犢牛的抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，小于或等于國(guó)家規(guī)定的臨界值時(shí)必須免疫。

關(guān)于免疫程序，有待進(jìn)一步探討。根據(jù)《2017年河南省動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫計(jì)劃》的要求，對(duì)所有牛、羊、駱駝、鹿進(jìn)行O型和亞洲I型口蹄疫免疫，對(duì)所有奶牛和種公牛進(jìn)行A型口蹄疫免疫，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)，操作規(guī)程進(jìn)行操作。免疫程序：90日齡左右犢牛進(jìn)行初免，所有新生家畜初免后，間隔1個(gè)月后進(jìn)行1次強(qiáng)化免疫，以后每隔4～6個(gè)月免疫1次。

據(jù)郭愛(ài)珍等《肉牛常用免疫程序》[2]，犢牛3月齡免疫?？谔阋咭呙?，免疫期6個(gè)月。根據(jù)筆者的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐，建議夏南牛犢?？谔阋呤酌鈺r(shí)間在40 d左右為宜，注射疫苗劑量2 mL/頭，在60日齡加強(qiáng)免疫1次，注射疫苗量2 mL/頭，以后每隔4～5個(gè)月免疫1次。同時(shí)建議在夏南牛主產(chǎn)區(qū)對(duì)肉牛實(shí)施口蹄疫O型、A型雙價(jià)苗免疫。

關(guān)于O型與A型口蹄疫疫苗抗體衰減不一致的問(wèn)題，筆者僅對(duì)數(shù)據(jù)分析，與疫苗質(zhì)量無(wú)關(guān)。