宣澤義,曹艷紅,吳柱月,黃明光,陳少梅,王凱悅，陳 宏， 雷初朝*

(1.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西 南寧 530001; 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

動(dòng)物Y染色體單倍型保持完整，不容易受重組和回復(fù)突變的影響，突變率較低，是進(jìn)化事件的忠實(shí)記錄者[1]。Y染色體單倍型分析可以揭示牛父系起源進(jìn)化的信息，G?therstr?m等[2]利用Y染色體單核苷酸多態(tài)性(Y-SNPs)定義了家牛3個(gè)Y染色體單倍型組(普通牛Y1和Y2以及瘤牛Y3單倍型組)。Bonfiglio等[3]在牛USP9Y基因的第26內(nèi)含子處鑒定了1個(gè)新的分子標(biāo)記，81 bp的插入能將Y1單倍型組與Y2和Y3單倍型組區(qū)分開(kāi)，而4個(gè)Y3特異性序列變異能把Y3單倍型組和Y2單倍型組區(qū)分開(kāi)。

我國(guó)黃牛品種資源十分豐富，根據(jù)2011年修訂的《中國(guó)畜禽遺傳資源志：牛志》記載，目前有53個(gè)地方黃牛品種、8個(gè)培育品種和11個(gè)國(guó)外引入品種[4]。本研究采集的公牛樣本采自廣西壯族自治區(qū)首府南寧市的一個(gè)大型肉牛屠宰場(chǎng)，按照區(qū)域地理分布將其統(tǒng)稱為“南寧?！?。為了探究廣西南寧市肉牛屠宰場(chǎng)屠宰的黃牛Y染色體單倍型組組成和父系起源，本研究對(duì)所采集的南寧肉牛樣本進(jìn)行Y染色體USP9Y基因多態(tài)性分析，以調(diào)查南寧屠宰市場(chǎng)上黃牛的父系遺傳背景，為了解南寧市場(chǎng)上肉牛的來(lái)源與遺傳組成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與基因組DNA提取

在廣西南寧市一屠宰場(chǎng)中采集73頭公牛的耳組織樣帶回實(shí)驗(yàn)室，采用苯酚—氯仿法提取全基因組DNA，放在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成與PCR擴(kuò)增

參照Bonfiglio等[3]發(fā)表的牛Y染色體USP9Y基因序列合成引物，上游引物為：F-5′-AAACCCTTCAAGGTAATAAAACAAAA-3′，下游引物為R：5′-CACAGCTCCTCAAAACCAGA-3′。PCR反應(yīng)體系為12.5 μL：ddH2O 5.00 μL，2×Taq MasterMix 6.00 μL，上下游引物各0.25 μL(10 pmol/μL)，模板DNA 1.00 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)與酶切分析

用2%的瓊脂糖凝膠對(duì)黃牛USP9Y基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增條帶大小進(jìn)行初步的Y染色體單倍型組判型，再用SspI限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。SspI酶切體系為8.0 μL：SspI酶(10.0 U/μL)0.4 μL(TaKaRa公司)，10×SspI Buffer 0.8 μL，PCR產(chǎn)物2.4 μL，ddH2O 4.4 μL。置于37 ℃的搖床1 h后，用2%的瓊脂糖凝膠對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，根據(jù)PCR產(chǎn)物被酶切的情況進(jìn)行單倍型組分析和統(tǒng)計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Arlequin V3.11軟件計(jì)算單倍型頻率和單倍型多樣度(H±SD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 南寧牛USP9Y基因PCR產(chǎn)物多態(tài)性與SspI酶切鑒定

通過(guò)對(duì)黃牛USP9Y基因的PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，73頭公牛USP9Y基因的PCR產(chǎn)物顯示471 bp和552 bp兩種帶型(圖1)。南寧牛有71個(gè)個(gè)體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為552 bp，僅有2個(gè)個(gè)體為471 bp，依據(jù)Bonfiglio等[3]的判定標(biāo)準(zhǔn)，這2個(gè)帶型為471 bp的南寧牛屬于普通牛Y1單倍型組，而剩余的71頭南寧牛是Y2還是Y3單倍型組需要通過(guò)SspI限制性內(nèi)切酶酶切的方法來(lái)進(jìn)一步區(qū)分。利用SspI酶對(duì)這71頭牛的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，發(fā)現(xiàn)有28頭牛的PCR產(chǎn)物能被SspI酶切開(kāi)成2條帶(215 bp和338 bp)，而有43頭牛的PCR產(chǎn)物不能被SspI酶切開(kāi)，只有1條帶552 bp，說(shuō)明這71頭南寧牛中有28頭牛屬于Y3單倍型組，43頭牛屬于Y2單倍型組。

注：M泳道為DL2000 marker，自上而下依次為2 000，1 000，750，500，250，100 bp。 〗圖1 南寧牛USP9Y基因的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增與酶切多態(tài)性

2.2 南寧牛Y染色體單倍型頻率和單倍型多樣度

對(duì)73頭南寧牛中Y1、Y2和Y3單倍型組個(gè)體進(jìn)行頻率統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示：Y1、Y2和Y3單倍型組分別有2，48，23個(gè)個(gè)體，所占頻率分別為2.74%，58.90%和38.36%。單倍型多樣度為0.5122±0.0309。

3 討 論

家牛Y-SNPs標(biāo)記已被廣泛用于世界牛品種/群體的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)、起源和遷徙路線等研究[5-6]。在對(duì)國(guó)外家牛品種的研究中，Son等[7]對(duì)東北亞地區(qū)蒙古、日本和韓國(guó)3個(gè)國(guó)家的牛品種分析表明，這些品種只擁有普通牛Y染色體單倍型組，而未檢測(cè)到瘤牛單倍型組。G?therstr?m等[2]和Ginja等[8]對(duì)多個(gè)歐洲家牛品種進(jìn)行分析，結(jié)果表明歐洲牛為普通牛起源，其中北歐品種主要是Y1單倍型組，南歐品種主要是Y2單倍型組。Edwards等[9]通過(guò)分析138個(gè)歐洲和亞洲牛品種表明，亞洲西南部主要為瘤牛Y3單倍型組，Y1和Y2單倍型組主要分布在英國(guó)、北歐和俄羅斯地區(qū)。

在中國(guó)部分地方黃牛品種的父系遺傳分析中，Li[10-11]等指出中國(guó)北方的家牛主要是Y2單倍型組，南方主要是Y3單倍型組，中原是Y2和Y3單倍型組的混合區(qū)。利用家牛2個(gè)經(jīng)典的Y-SNPs標(biāo)記(ZFY10和UTY19)，趙曉誠(chéng)等[12]分析了嶺南牛的Y染色體多態(tài)性，指出嶺南牛的父系起源以瘤牛為主，普通牛為輔；夏小婷等[13]結(jié)合Y-SNPs與Y-STRs的分型結(jié)果，發(fā)現(xiàn)關(guān)嶺牛主要以Y3單倍型組為主；李芳玉等[14]利用49頭大別山牛的2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記及2個(gè)Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大別山牛只有瘤牛Y3父系起源。李秀良等[15]對(duì)28頭潿洲牛進(jìn)行分析，結(jié)果顯示28頭潿洲牛有Y3-88-156和Y3-90-156兩種單倍型，單倍型頻率分別為89.29%和10.71%，說(shuō)明潿洲牛只有1個(gè)瘤牛Y3父系起源。從以上研究可以看出，中國(guó)南方黃牛主要是Y3單倍型組。

在本研究中，通過(guò)對(duì)73頭南寧市一屠宰場(chǎng)的黃牛Y染色體上USP9Y基因的多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)南寧牛有普通牛(Y1和Y2單倍型組)和瘤牛(Y3單倍型組)2個(gè)不同的父系起源，以Y2單倍型組為主，還包括少量的Y1單倍型組。根據(jù)地域分析，南寧牛屬于南方黃牛類型，這與常振華等[1]、Li等[10]和李秀良等[15]指出的中國(guó)南方黃牛品種的起源進(jìn)化不一致，表明南寧市屠宰場(chǎng)屠宰的肉牛來(lái)源比較復(fù)雜。傳統(tǒng)上中國(guó)黃牛主要是役用，但近幾十年來(lái)，人們對(duì)黃牛肉用價(jià)值的需求大大提高，為了提高我國(guó)黃牛的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，從國(guó)外引入一些肉牛品種，如：以Y2單倍型組為主的皮埃蒙特牛、夏洛萊牛、利木贊牛、西門塔爾牛等；以Y1單倍型組為主的安格斯牛、荷斯坦牛等來(lái)提高我國(guó)黃牛的生長(zhǎng)發(fā)育性能，導(dǎo)致全國(guó)各地的地方品種都因此而混雜，純種數(shù)量急劇減少。因此，南寧市屠宰場(chǎng)屠宰的肉牛呈現(xiàn)較高的Y2單倍型組頻率以及低頻率的Y1單倍型組頻率，一方面，說(shuō)明廣西地方黃牛品種也大量與國(guó)外引進(jìn)的肉牛品種雜交；另一方面，說(shuō)明廣西南寧市肉牛屠宰場(chǎng)從周邊省市大量購(gòu)買雜交肉牛和少量育肥的奶公犢。從廣西南寧市肉牛屠宰場(chǎng)的Y染色體父系起源來(lái)看，如火如荼的利用國(guó)外商品肉牛品種與全國(guó)各地地方黃牛品種的雜交模式，已經(jīng)遍地開(kāi)花，連比較偏遠(yuǎn)、經(jīng)濟(jì)相對(duì)落后的西南部，如廣西地區(qū)也不例外。因此，從保護(hù)中國(guó)豐富的地方黃牛品種資源來(lái)看，全國(guó)各地加大地方黃牛品質(zhì)資源的保護(hù)已經(jīng)刻不容緩，如果再不加大保護(hù)力度，再過(guò)20年左右，中國(guó)寶貴的、引以為傲的豐富地方黃牛品種就會(huì)消失殆盡。