羅鈺 王騰飛 李文靜 王金娥 裴仁軍

摘?要?人凝血因子7a （FVIIa）是外源性凝血途徑的核心因子，檢測(cè)參與凝血過(guò)程的FVIIa及針對(duì)FVIIa開(kāi)發(fā)安全有效和經(jīng)濟(jì)的凝血?jiǎng)┖涂鼓獎(jiǎng)┦蔷哂兄匾囊饬x。本研究基于指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) （Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），采用酸纖維素膜法，通過(guò)11輪篩選成功分離出FVIIa的DNA適配體，并模擬了其二級(jí)結(jié)構(gòu)。此適配體與FVIIa蛋白結(jié)合的表觀解離常數(shù)為102 nmol/L。同時(shí)，基于所獲得的高親和力適配體，建立了基于適配體的熒光檢測(cè)方法。本方法簡(jiǎn)單高效，對(duì)FVIIa蛋白的定量檢測(cè)范圍達(dá)到30～80 nmol/L，為人凝血因子7a的檢測(cè)提供了一條新途徑。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和適配體的熒光檢測(cè)方法結(jié)果表明， 此適配體具有良好的選擇性。

關(guān)鍵詞?凝血因子7a; 適配體; 指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù); 篩選; 熒光檢測(cè)

1?引 言

經(jīng)典凝血假說(shuō)認(rèn)為，在高等生命體中的凝血機(jī)制存在兩個(gè)啟動(dòng)過(guò)程，分別是內(nèi)源性凝血和外源性凝血 [1]。在正常的凝血過(guò)程及各種血栓性疾病中，凝血過(guò)程通過(guò)激活外源性途徑觸發(fā)。外源性凝血由凝血因子7a（Factor VIIa，F(xiàn)VIIa）與組織因子（Tissue factor，TF）形成的復(fù)合物引發(fā)[2，3]。FVIIa是一種胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，在缺乏組織因子的情況下，對(duì)大分子底物的活性較低[4]。TF-FVIIa復(fù)合物的形成為大分子底物提供了一個(gè)合適的結(jié)合面，并通過(guò)改變FVIIa的活性位點(diǎn)提高其催化性能[5，6]。經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)，TF-FVIIa復(fù)合物通過(guò)外源性凝血途徑最終促成纖維蛋白凝塊的形成，參與凝血[7]。盡管此凝血途徑的作用機(jī)制已被闡明，但現(xiàn)有技術(shù)對(duì)診斷和治療由各凝血因子障礙而引起的血液疾病仍存在明顯不足。因此，檢測(cè)參與凝血過(guò)程的各因子，并針對(duì)特定疾病開(kāi)發(fā)安全有效和低成本的凝血?jiǎng)┖涂鼓獎(jiǎng)?，仍然是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。

適配體是通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) （Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX） 在體外篩選獲得的一種單鏈核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸，對(duì)其相應(yīng)的靶標(biāo)具有高親和力和高選擇性[8～11]。作為一種功能化核酸，適配體可用于對(duì)靶標(biāo)分子的識(shí)別[12]。目前，很多適配體序列已被成功分離，相應(yīng)的靶標(biāo)包含小分子[13]、蛋白質(zhì)[14]、細(xì)胞系[15]、病毒[16]等。有多種方法被用于篩選蛋白靶標(biāo)，如親和色譜柱法 [17]、磁珠法[18]、硝酸纖維素膜法[19]等。由于適配體具有高靈敏度、高特異性的特點(diǎn)，基于適配體的傳感器近年也得到了迅猛發(fā)展[20，21]。目前，已發(fā)展出可用于小分子檢測(cè)[13，22]、蛋白分子檢測(cè)[23]、細(xì)胞成像[15，24]?等的適配體傳感器。

本研究以外源性凝血途徑的核心因子FVIIa為靶蛋白，基于硝酸纖維素膜分離的篩選方法，成功分離出FVIIa的DNA適配體，此適配體與FVIIa蛋白結(jié)合的表觀解離常數(shù)為102 nmol/L，并具有較好的選擇性。基于所獲得的高親和力適配體，建立了一種簡(jiǎn)單的熒光傳感方法，用于檢測(cè)FVIIa蛋白。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

Eppendorf Mastercycler Nexus PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）; VICTOR×4酶標(biāo)儀（美國(guó)PerkinElmer公司）; 電泳儀（美國(guó)BioRad公司）; LAS 4000 mini凝膠成像系統(tǒng)（日本Fujifilm公司）。

人凝血因子 7a蛋白由諾和諾德中國(guó)研發(fā)中心周蓉博士提供; ?DNA序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）; 0.45-μm硝酸纖維素膜（通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)貿(mào)易發(fā)展（上海）有限公司）; 25-mm 可拆卸濾器（默克密理博實(shí)驗(yàn)室設(shè)備（上海）有限公司）; 鏈霉親和素瓊脂糖微珠、SYBR Green Ι（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）; 10×PCR緩沖液、脫氧核苷三磷酸（dNTPs）、rTaq 聚合酶、20 bp DNA Marker、6×DNA上樣緩沖液、PMD18-T載體克隆試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司）; 工程化大腸桿菌 BL21 （美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)）; 10×PBS緩沖液、5×TBE緩沖液、鮭魚(yú)精DNA、LB液體培養(yǎng)基（干粉）、LB固體培養(yǎng)基（干粉）、30% 丙烯酰胺、10% 過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺（北京索萊寶科技有限公司）; 瓊脂糖、NaOH、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、MgCl2、牛血清白蛋白、十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸、Na2CO3、NaHCO3（西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司）。所用試劑均為分析純， 實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?溶液配制?結(jié)合緩沖液為1×PBS， 5 mmol/L MgCl2， 0.1 mg/mL牛血清白蛋白， 25 μg/mL鮭魚(yú)精DNA。儲(chǔ)備溶液為2×結(jié)合緩沖液。各溶液配制后于20℃保存。

洗脫緩沖液含7 mol/L 尿素、7 mmol/L 十二烷基硫酸鈉和1 mmol/L 乙二胺四乙酸。儲(chǔ)備溶液為1×洗脫緩沖液。配制后于4℃保存。

純化液為鮭魚(yú)精DNA、乙酸鈉和無(wú)水乙醇的混合液： 準(zhǔn)確稱(chēng)取20 mg 鮭魚(yú)精DNA、12.30 g NaAC溶于50 mL水中，并用乙酸調(diào)節(jié)至pH 5.2，以無(wú)水乙醇定容至500 mL，混勻，于20℃保存。

包被液為0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH=9.6），封閉液為3%（w/V））牛血清白蛋白溶液。

2.2.2?篩選過(guò)程?（1）負(fù)篩選過(guò)程?取100 μmol/L 隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)20 μL 溶于50 μL水中，95℃水浴加熱5 min，取出冷卻至室溫，加入50 μL 2×結(jié)合緩沖液，輕微振蕩搖勻。室溫下與純凈的硝酸纖維素膜共孵育1 h，棄膜，收集上清液，用于后續(xù)正篩選。（2）正篩選過(guò)程?將上述處理過(guò)的隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)與200 μL人凝血因子7a 蛋白溶液于室溫下共孵育1 h。將硝酸纖維素膜固定在可拆卸濾器中，使用1×結(jié)合緩沖液潤(rùn)濕濾器中的硝酸纖維素膜，使共孵育液緩慢的通過(guò)硝酸纖維素膜，此過(guò)程重復(fù)5次。使用800 μL 1×結(jié)合緩沖液緩慢洗去游離在膜表面的寡核苷酸序列，此過(guò)程重復(fù)3次。（3）變性?將硝酸纖維素膜取出并將其剪碎，轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中。加入200 μL 洗脫緩沖液，充分振蕩。95℃水浴加熱10 min，使蛋白變性，與寡核苷酸分離。此過(guò)程重復(fù)2次，合并兩次洗脫液。（4）純化?加入1 mL純化液，80℃ 靜置2 h。4℃ 下14000 r/min 離心25 min。棄上清液，加入1 mL 70%（V/V）預(yù)冷乙醇，重復(fù)離心1次，棄上清液，65℃ 烘箱中烘干。（5）擴(kuò)增?將干燥的寡核苷酸粉末用150 μL水溶解。每個(gè)PCR反應(yīng)體系為50 μL，每個(gè)反應(yīng)體系含有400 μmol/L dNTPs、1 μmol/L 正向引物、1 μmol/L 反向引物、25 U/mL rTaq聚合酶、5 μL 10×PCR緩沖液、2 μL DNA模板，總反應(yīng)體系6 mL; 將PCR程序設(shè)置為： 95℃ 5 min; 94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s（將此步設(shè)為10～20個(gè)循環(huán)）; 72℃ 5 min; 10℃ 保持至結(jié)束。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳以檢驗(yàn)產(chǎn)物純度，取 8 μL PCR 產(chǎn)物與 2 μL 6×DNA電泳緩沖液（每 mL 含有 SYBR GReen I 10 μL）混勻后上樣，凝膠為3%非變性瓊脂糖凝膠，電泳緩沖溶液為1×TBE緩沖液，電壓為140 V。電泳結(jié)束后利用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)其拍照并分析。（6）制備單鏈?將PCR產(chǎn)物與鏈霉親和素修飾的瓊脂糖親和柱孵育，由于PCR使用生物素標(biāo)記的反向引物，利用生物素和親和素的相互作用將PCR產(chǎn)物固定在親和柱上。用800 μL 1×結(jié)合緩沖液洗3次后，用0.1 mol/L NaOH溶液洗脫ssDNA，并用適量HCl中和NaOH。加入1 mL 預(yù)冷無(wú)水乙醇，80℃靜置2 h。4℃下14000 r/min 離心25 min。棄上清液，加入1 mL 70%（V/V）預(yù)冷乙醇; 重復(fù)離心1次，棄上清液，65℃烘干。將干燥的寡核苷酸粉末用20 μL水溶解，取1 μL稀釋至50 μL，測(cè)定260 nm處的吸光度，計(jì)算其中寡核苷酸含量。重復(fù)步驟（1）～（6）。自第二輪篩選開(kāi)始寡核苷酸隨機(jī)文庫(kù)的用量降至300 pmol。

2.2.3?測(cè)序與序列分析?擴(kuò)增經(jīng)過(guò)數(shù)次篩選的富集庫(kù)，轉(zhuǎn)入工程化大腸桿菌BL21中， 37℃ 培養(yǎng)過(guò)夜; 挑取隨機(jī)菌落并送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

利用序列比對(duì)程序?qū)λ眯蛄羞M(jìn)行分析，如 ClustalX 1.83 比對(duì)序列，分析適配體序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)及其同源性，將各序列分組，并用 NUPACK 模擬其二級(jí)結(jié)構(gòu)，選擇結(jié)構(gòu)具有代表性的序列進(jìn)行合成，以進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2.4?熒光測(cè)量?將96 孔ELISA酶標(biāo)板用200 μL 1×結(jié)合緩沖液預(yù)先潤(rùn)洗1次，孔中包被100 pmol靶蛋白溶液（1 μmol/L， 100 μL，使用包被液稀釋?zhuān)?，或等量?duì)照蛋白（牛血清白蛋白和鏈霉親和素），4℃ 下濕盒中過(guò)夜，棄去蛋白溶液。在包被蛋白的孔中加入封閉液，37℃孵育2 h; 將50 μL FITC修飾的隨機(jī)文庫(kù)或適配體序列在95℃水浴中加熱5 min，取出冷卻至室溫，加入50 μL 2×結(jié)合緩沖液，混勻后加入處理過(guò)的酶標(biāo)板中，37℃下孵育2 h; 用1×PBS洗去游離的DNA，使用酶標(biāo)儀讀取（底讀）實(shí)驗(yàn)孔在485 nm處熒光強(qiáng)度。

2.2.5?非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳?將100 pmol 靶蛋白（20 μmol/L， 5 μL） 與 200 pmol （200 μmol/L， 1 μL） 已預(yù)先退火的熒光標(biāo)記的適配體鏈混勻，加入4 μL 2×結(jié)合緩沖液，室溫下孵育1 h， 同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照及牛血清白蛋白和鏈霉親和素作為陰性對(duì)照。孵育后加入2 μL 6×DNA上樣緩沖液，混勻后上樣。凝膠為8% 非變性聚丙烯酰胺凝膠，電泳電壓80 V。電泳結(jié)束后利用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)其拍照并分析。

2.2.6?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?采用Origin Pro 8.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間差異分析采用t檢驗(yàn)， 組間多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

3?結(jié)果與討論

3.1?篩選方法

本研究選擇硝酸纖維素膜分離方法用于篩選靶蛋白FVIIa的DNA核酸適配體。在篩選過(guò)程中，先使蛋白與核酸文庫(kù)在緩沖溶液中孵育，再依靠膜對(duì)蛋白的吸附作用分離有作用的DNA序列。這種先孵育再分離的方法使得蛋白與適配體的結(jié)合在液相均相中進(jìn)行。

硝酸纖維素膜對(duì)蛋白的吸附作用使得適配體-蛋白復(fù)合物保留在膜表面，再用緩沖液洗去游離在膜表面的未結(jié)合的序列，留存在膜上的DNA經(jīng)過(guò)提取純化后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)入到下一輪篩選中。

采用熒光法監(jiān)測(cè)篩選過(guò)程中庫(kù)的富集效果。FITC標(biāo)記的核酸庫(kù)由FITC標(biāo)記的正向引物通過(guò)PCR反應(yīng)制得。如圖1所示，隨著篩選輪數(shù)的增加，保留在蛋白表面的序列增多，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。經(jīng)過(guò)11輪富集，熒光強(qiáng)度不再發(fā)生明顯增長(zhǎng)，因此對(duì)第11輪文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

3.2?測(cè)序結(jié)果

經(jīng)第11輪篩選的文庫(kù)被轉(zhuǎn)入工程化大腸桿菌BL21中，培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取隨機(jī)單克隆菌落進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，結(jié)果如圖2所示。將所獲得序列通過(guò)M-fold （http：//unafold.rna.albany.edu/） 做二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬，合成有一定同源性且二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定的序列，并做進(jìn)一步分析。如圖3所示， 選擇FVIIa-7和FVIIa-16， 并在5'端標(biāo)記FITC， 以進(jìn)一步考察親和力和特異性等，F(xiàn)VIIa-7和FVIIa-16的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3所示。相關(guān)寡核苷酸序列見(jiàn)表1。

3.3?親和力測(cè)定

通過(guò)熒光法測(cè)定適配體的親和力（解離常數(shù)）。先將靶蛋白固定在酶標(biāo)板上，再使之與熒光標(biāo)記的適配體作用。除去游離在表面的適配體，可檢測(cè)的熒光信號(hào)全部來(lái)自與蛋白作用的適配體，熒光信號(hào)越強(qiáng)，說(shuō)明與蛋白作用的適配體越多。本方法操作簡(jiǎn)單，所需試劑種類(lèi)及數(shù)量較少，是一種簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的表征方法。如圖4所示，配制終濃度為0、10、25、50、75、100、125、150、200、300、400和500 nmol/L的適配體（每孔100 μL）與靶蛋白作用，按公式（1）擬合，解離常數(shù)（Kd）計(jì)算結(jié)果由Graphpad Prism 5給出：

其中， F為加入適配體后的熒光信號(hào)，F(xiàn)0為背景信號(hào)， c為所加入適配體的濃度， Fmax為擬合曲線Y軸上最高點(diǎn)， Kd為所求的解離常數(shù)。

FVIIa-7的解離常數(shù)為296.3 nmol/L（圖4A），而FVIIa-16具有更高的親和力，解離常數(shù)為102.0 nmol/L（圖4B）。

3.4?FVIIa的定量檢測(cè)

采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法確定FVIIa-16對(duì)靶蛋白的檢測(cè)濃度范圍。

實(shí)驗(yàn)原理如圖5所示，在溶液相中加入不同量的蛋白，與適量的適配體孵育，再將含有蛋白-適配體復(fù)合物、游離蛋白、游離適配體的混合溶液加入到包被了FVIIa蛋白的酶標(biāo)板中，通過(guò)測(cè)定與酶標(biāo)板上固定蛋白結(jié)合的適配體發(fā)出的熒光信號(hào)，間接反映待測(cè)溶液中FVIIa蛋白的濃度。

首先在酶標(biāo)板中包被100 pmol靶蛋白，將終濃度為0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、150、200和300 nmol/L 的靶蛋白與200 pmol已變性處理的適配體在結(jié)合緩沖液中 （總體積100 μL）于 37℃孵育1 h，將溶液依次轉(zhuǎn)移至包被有蛋白的酶標(biāo)板中，37℃下孵育2 h; 洗去游離的DNA，測(cè)定各孔在485 nm 的熒光強(qiáng)度。如圖6所示，適配體對(duì)FVIIa-16定量檢測(cè)范圍為30～80 nmol/L，線性回歸方程為 ΔF485 nm=-6.18C （nmol/L） + 602.27（R2=0.978）。

3.5?方法的特異性

通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳考察適配體的特異性 [18]，如圖7所示，熒光標(biāo)記的適配體與FVIIa結(jié)合后，相比于對(duì)照組蛋白條帶滯后。利用熒光法檢驗(yàn)了熒光標(biāo)記的適配體與FVIIa及對(duì)照組蛋白間的作用，酶標(biāo)板中每孔包被100 pmol蛋白，與300 pmol 已變性處理的適配體孵育，記錄其熒光強(qiáng)度; 基于t檢驗(yàn)計(jì)算同種蛋白組間顯著性差異，結(jié)果如圖8所示，空白對(duì)照組為不加適配體的蛋白本底熒光值，樣品組為加入熒光標(biāo)記適配體的響應(yīng)值，結(jié)果表明，F(xiàn)VIIa-16能顯著區(qū)分靶蛋白的空白對(duì)照與樣品組，而不與其它對(duì)照蛋白作用，具有良好的特異性。

4?結(jié) 論

采用硝酸纖維素膜法，經(jīng)過(guò)11輪篩選，成功篩選分離了人凝血因子FVIIa的DNA適配體。此適配體的表觀解離常數(shù)為102.0 nmol/L，對(duì)FVIIa定量檢測(cè)范圍為30～80 nmol/L，具有良好的選擇性。FVIIa蛋白的RNA適配體已被成功分離，此適配體可通過(guò)阻止TF-FVIIa復(fù)合物的形成影響FVIIa，并延長(zhǎng)凝血時(shí)間[25]。但RNA成本高，并需要嚴(yán)格的使用環(huán)境。DNA適配體成本較RNA適配體低，合成簡(jiǎn)單，并具有更好的穩(wěn)定性。本研究篩選的DNA適配體與FVIIa有較高的親和性，可用于FVIIa的高靈敏、高選擇性的檢測(cè)，并有望基于此適配體開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)有效的凝血?jiǎng)┗蚩鼓齽?/p>

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