張曉瑩 吳鋒

(江蘇省南通市第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉科 南通 226002)

喉鱗癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，惡性程度高，易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。喉鱗癌的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，多數(shù)研究[1-4]認(rèn)為惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多基因、多步驟的復(fù)雜過程。非組蛋白染色體蛋白HMGA2在多種腫瘤中都呈現(xiàn)較高的表達(dá)水平，是新癌基因之一，在多種腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中都有著調(diào)控功能。近年來關(guān)于高遷移率族蛋白HMGA2在腫瘤中的研究越來越多，其最早在胚胎組織中被發(fā)現(xiàn)，而在成熟分化的組織中幾乎檢測(cè)不到，但在許多惡性腫瘤中卻可以檢測(cè)出來。HMGA2雖然分子量小，卻可以作為“構(gòu)筑轉(zhuǎn)錄因子”參與多種基因的調(diào)控表達(dá)，進(jìn)而通過多條分子通路參與細(xì)胞的增殖、分化、侵襲與轉(zhuǎn)移，被認(rèn)為具有癌基因的特征。因此，許多研究都認(rèn)為HMGA2在喉鱗癌發(fā)生過程中起重要作用，可能成為喉鱗癌的治療靶點(diǎn)[5-6]。眾多研究也同時(shí)顯示，miRNAs在調(diào)控喉鱗癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路中也有至關(guān)重要的作用，并具有成為喉鱗癌診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)的潛力。本實(shí)驗(yàn)研究miR-98-5p通過靶向調(diào)控HMGA2在喉鱗癌中的相關(guān)作用及意義，為診斷及治療喉鱗癌提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 本研究中納入120例喉鱗癌患者，均于2016年 1月～2017年12月在本科接受全喉或部分喉切除手術(shù)?；颊咧熬唇?jīng)任何治療，平均年齡為(49.81±7.57)歲。喉鱗癌組織和癌旁組織(距癌組織邊緣2 cm內(nèi)區(qū)域)在5 min內(nèi)被切除，立即投入液氮內(nèi)，并長期保存在-80 ℃冰箱。

1.2 外周血采集 針對(duì)納入研究的喉鱗癌患者，均于清晨空腹?fàn)顩r下抽取外周靜脈血。具體操作如下：采用一次性血清分離膠管，抽取外周靜脈血約3 mL；待血清析出后以1 000 g離心10 min，取上層血清保存至-80 ℃冰箱待檢測(cè)。

1.3 定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)外周血miR-98-5p和HMGA2的表達(dá) 取0.5 mL血清標(biāo)本，采用Trizol 法提取血清總RNA。實(shí)驗(yàn)步驟按照Trizol試劑盒說明書中步驟進(jìn)行。將提取到的總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。按照qRT-PCR 試劑盒說明書進(jìn)行PCR：采用50 μL反應(yīng)體系，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min， 共40個(gè)循環(huán)。miR-98-5p計(jì)算采用U6作為內(nèi)參，HMGA2采用GAPDH作為內(nèi)參。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hep-2細(xì)胞以含10%胎牛血清的培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，再用2.5% 的胰蛋白酶每2 d進(jìn)行消化，傳代，并取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長期Hep-2細(xì)胞(1～1.5)×106個(gè)分板，接種于6孔板中,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度60%～70%之后,再將細(xì)胞分為2組：miRNA對(duì)照轉(zhuǎn)染組以及miR-23過表達(dá)的miRNA轉(zhuǎn)染組,并將培養(yǎng)基換成每孔1 mL無血清無雙抗的培養(yǎng)基；miRNA及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000分別用100 μL OMEM稀釋后，依照說明書所需比例混勻后靜置20 min，逐滴加入并且輕晃混勻, 培養(yǎng)6 h后；再換為含完全培養(yǎng)基，待48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行下一步分析。

1.5 熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)miR-98-5p與靶基因HMGA2的結(jié)合 構(gòu)建HMGA2野生型3′-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-HMGA2-wt，并以pMIR-HMGA2-wt質(zhì)粒為模板，利用PCR搭橋法(overlapping PCR)構(gòu)建其潛在結(jié)合位點(diǎn)突變型報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-HMGA2-Mut。將miR-98-5p mimics、陰性對(duì)照組miRNA mimics(miR-NC)內(nèi)參海腎熒光素酶以及pMIR-HMGA2-wt和pMIR-HMGA2-Mut報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)Hep-2細(xì)胞中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后收取細(xì)胞液，使用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒測(cè)定熒光素酶活性。

1.6 Western印跡 采用含50 mmol/L Tris-HCl (pH=7.4)、150 mmol/L NaCl、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1% 十二烷基硫酸鈉(SDS)和蛋白酶抑制劑及1 mmol/L苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液分離蛋白質(zhì)，通過SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，按說明書進(jìn)行Western印跡實(shí)驗(yàn)。

1.7 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖 制備單細(xì)胞懸液：收集對(duì)數(shù)生長期的Hep-2細(xì)胞，以1×105/mL 接種于96孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)基200 μL。經(jīng)過12 h后，分別用miR-NC和miR-98-5p轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞，每組6個(gè)復(fù)孔。在37 ℃條件下培養(yǎng)，經(jīng)過48 h后每孔加入200 μL CCK-8 再持續(xù)培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm處吸光度(optical density，OD)值。

1.8 流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞周期 懸浮并收集不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞，生理鹽水沖洗細(xì)胞2遍，70%乙醇固定細(xì)胞。加入碘化丙啶DNA熒光染色(propidium iodide,PI:50 mg/L,1% Triton X-100)，4 ℃冰箱避光染色30 min，銅網(wǎng)過濾，使樣本成為合格的單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.9 鱗癌Hep-2細(xì)胞懸液制備 取對(duì)數(shù)生長期 Hep-2細(xì)胞，胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，RMPI-1640液洗滌，吹打成懸液，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)調(diào)整細(xì)胞數(shù)至 1×109備用。

1.10 構(gòu)建裸鼠喉鱗癌皮下移植模型 在裸鼠右肩胛近腋窩處皮下接種喉鱗癌Hep-2細(xì)胞懸液0.2 mL，觀察接種部位液體吸收、腫瘤生長過程及裸鼠狀況。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-98-5p在喉鱗癌患者細(xì)胞中的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)喉鱗癌組織和癌旁正常組織中miR-98-5p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，相比癌旁正常組織，喉鱗癌組織中miR-98-5p的表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1A)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的喉鱗癌組織中miR-98-5p的表達(dá)水平明顯低于無轉(zhuǎn)移的腫瘤組織(圖1B)。結(jié)果顯示，miR-98-5p可能對(duì)喉鱗癌存在一定的調(diào)控作用。

圖1. miR-98-5p在喉鱗癌患者細(xì)胞中的表達(dá) A.喉癌組織與癌旁正常組織比較；B.有轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移組比較；*示P<0.01；**示P<0.05

2.2 臨床特征 對(duì)納入研究的喉癌患者組織進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示喉鱗癌組織中miR-98-5p的平均表達(dá)水平為0.69±0.17。以均數(shù)0.69為分界值，表達(dá)量≥0.69為miR-98-5p高表達(dá)，表達(dá)量<0.69為miR-98-5p低表達(dá)。將miR-98-5p的表達(dá)高低與患者臨床特征進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，miR-98-5p與年齡、性別無明顯相關(guān)性(P>0.05)。miR-98-5p高表達(dá)患者的癌組織分化程度及臨床分期較低(P<0.05)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中miR-98-5p的表達(dá)水平明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.01，表1)。

2.3 miR-98-5p通過結(jié)合HMGA2的 3′-UTR來抑制HMGA2的表達(dá) 對(duì)microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，預(yù)測(cè)HMGA2為miR-98-5p的潛在靶基因(圖2A)。構(gòu)建了HMGA2野生型3′-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-HMGA2-wt及突變型報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-HMGA2-Mut。將miR-98-5pmimics，miR-NC、內(nèi)參海腎熒光素酶以及pMIR-HMGA2-wt和pMIR-HMGA2-Mut報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)Hep-2細(xì)胞中，雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-98-5pmimics可明顯抑制pMIR-HMGA2-wt質(zhì)粒熒光素酶活性；而對(duì)pMIR-HMGA2-Mut熒光素酶活性無明顯影響(圖2B)。表明miR-98-5p可以通過結(jié)合HMGA2的3′-UTR而抑制HMGA2的表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-98-5p對(duì)HMGA2的調(diào)控作用，通過qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-98-5pmimics轉(zhuǎn)染組中HMGA2的mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(圖2C)，并且Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，miR-98-5pmimics轉(zhuǎn)染組中HMGA2表達(dá)量明顯降低(圖2D)。上述結(jié)果表明，miR-98-5p能夠抑制HMGA2的mRNA翻譯及其蛋白表達(dá)。

表1 miR-98-5p的表達(dá)水平與喉鱗癌患者臨床特征的相關(guān)性(n)

2.4HMGA2在喉鱗癌組織中mRNA的表達(dá)水平 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，喉鱗癌組織相比癌旁正常組織，HMGA2的mRNA表達(dá)量明顯升高(圖3)。

2.5 miR-98-5p和HMGA2與細(xì)胞增殖及周期的相關(guān)性 將miR-NC, miR-98-5pmimics和HMGA2轉(zhuǎn)染進(jìn)Hep-2細(xì)胞,采用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組、miR-98-5pmimics轉(zhuǎn)染組和miR-98-5pmimics+HMGA2轉(zhuǎn)染組發(fā)現(xiàn)，miR-98-5pmimics轉(zhuǎn)染組的OD值明顯低于對(duì)照組，而miR-98-5pmimics+HMGA2轉(zhuǎn)染組的OD值明顯高于miR-98-5pmimics轉(zhuǎn)染組(圖4A)。流式細(xì)胞法檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-98-5pmimics轉(zhuǎn)染組S期細(xì)胞比值明顯低于對(duì)照組,而miR-98-5pmimics+HMGA2轉(zhuǎn)染組S期細(xì)胞比值明顯高于miR-98-5pmimics轉(zhuǎn)染組(圖4B)。以上結(jié)果表明，miR-98-5p可抑制喉鱗癌細(xì)胞Hep-2的增殖和細(xì)胞周期在S期聚集，而這些抑制效果可被HMGA2補(bǔ)回。

圖2. HMGA2是miR-98-5p的靶基因 *示P<0.01

圖3. 靶基因HMGA2的mRNA的表達(dá)水平 *示P<0.01

圖4. miR-98-5p和HMGA2對(duì)細(xì)胞增殖及周期的調(diào)控作用*示P<0.01

2.6 miR-98-5p抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤生長 21 d后發(fā)現(xiàn)，miR-98-5pmimics轉(zhuǎn)染組裸鼠腫瘤體積及重量均明顯低于對(duì)照組(圖5A、B)，并且miR-98-5p在miR-98-5pmimics轉(zhuǎn)染組小鼠腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(圖5C)，表明在裸鼠體內(nèi)，miR-98-5p過表達(dá)能夠抑制Hep-2細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤的生長。

圖5. miR-98-5p抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤生長 *示P<0.01

3 討論

目前喉鱗癌患者確診時(shí)已發(fā)展至Ⅲ～Ⅳ期者占40%，因此喉鱗癌的早期診斷與治療顯得尤為重要，然而目前為止還未發(fā)現(xiàn)能早期預(yù)測(cè)喉鱗癌的分子標(biāo)志物[7-9]。 miRNA是一段大約由19～25個(gè)核苷酸組成的非編碼小RNA，通過對(duì)其靶 mRNA的翻譯抑制或者降解在動(dòng)、植物體內(nèi)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA按照其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)控作用可分為致癌miRNA和抑癌miRNA，調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡及血管生成情況[10]。

本研究采用qRT-PCR檢測(cè)喉鱗癌[11-13]組織和癌旁正常組織中miR-98-5p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)相比癌旁正常組織，喉鱗癌組織中miR-98-5p的表達(dá)水平明顯降低。在構(gòu)建裸鼠喉鱗癌皮下移植模型中，證明miR-98-5p在miR-98-5pmimics轉(zhuǎn)染組裸鼠腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，因此表明miR-98-5p對(duì)喉鱗癌有調(diào)控作用。

有研究[14]報(bào)道，通過雙向電泳在柯斯頓鼠肉瘤病毒(KiMSV)轉(zhuǎn)化鼠甲狀腺細(xì)胞株(FRTL5)中發(fā)現(xiàn)HMGA2與腫瘤表現(xiàn)型之間的聯(lián)系，當(dāng)時(shí)在細(xì)胞轉(zhuǎn)化后共發(fā)現(xiàn)3種磷酸化的核蛋白質(zhì)，標(biāo)記為C、D、E，分別對(duì)應(yīng)現(xiàn)在所指的HMGA2，HMGAla和HMGAlb。Berlingieri等[15]通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，以上這些磷酸化的蛋白質(zhì)在反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的無完全惡性表型的鼠甲狀腺細(xì)胞株中不表達(dá)，在有完全惡性表型的細(xì)胞株中則持續(xù)表達(dá)。Rice等[16]進(jìn)一步證明了HMGA2的致癌活性。他們發(fā)現(xiàn)HMGA2表達(dá)增高的細(xì)胞系呈現(xiàn)出不依賴支持物生長的特性，而且在注入裸鼠體內(nèi)后出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

在本研究中，我們通過microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，預(yù)測(cè)HMGA2為miR-98-5p的潛在靶基因，使用雙熒光素酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-98-5p可以通過結(jié)合HMGA2的3′-UTR[17-18]進(jìn)而抑制HMGA2的表達(dá)。通過qRT-PCR和Western印跡確定miR-98-5p可以抑制HMGA2的mRNA和蛋白表達(dá)水平，更加驗(yàn)證了miR-98-5p對(duì)HMGA2的靶向調(diào)控作用。同時(shí)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果也顯示喉鱗癌組織相比癌旁正常組織，HMGA2的mRNA表達(dá)量明顯升高，因此說明HMGA2對(duì)喉鱗癌具有調(diào)控功能。然后采用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組、miR-98-5pmimics轉(zhuǎn)染組和miR-98-5pmimics+HMGA2轉(zhuǎn)染組發(fā)現(xiàn)，miR-98-5pmimics轉(zhuǎn)染組的OD值明顯低于對(duì)照組,而miR-98-5pmimics+HMGA2轉(zhuǎn)染組的OD值明顯高于miR-98-5pmimics轉(zhuǎn)染組。同時(shí)流式細(xì)胞法檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-98-5pmimics轉(zhuǎn)染組S期細(xì)胞比值明顯低于對(duì)照組,而miR-98-5pmimics+HMGA2轉(zhuǎn)染組S期細(xì)胞比值明顯高于miR-98-5pmimics轉(zhuǎn)染組。結(jié)果表明，miR-98-5p可抑制喉鱗癌Hep-2細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期在S期聚集，而這些抑制效果可被HMGA2補(bǔ)回。在裸鼠喉鱗癌皮下移植模型實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)miR-98-5pmimics轉(zhuǎn)染組裸鼠腫瘤體積及重量均明顯低于對(duì)照組，并且miR-98-5p在miR-98-5pmimics轉(zhuǎn)染組裸鼠喉鱗癌組織中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。通過本次研究，預(yù)示miR-98-5p能夠通過抑制HMAG2的表達(dá)抑制喉鱗癌。

綜上所述，miR-98-5p可抑制喉鱗癌Hep-2細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期在S期聚集，而這些抑制效果可被HMAG2補(bǔ)回，并且miR-98-5p能夠抑制HMAG2的表達(dá)水平并抑制喉鱗癌細(xì)胞的增殖，對(duì)喉鱗癌有抑制效果。此外，本研究納入150例患者中女性74例，考慮既往文獻(xiàn)報(bào)道喉癌女性發(fā)病率遠(yuǎn)低于男性，因此本研究尚存在研究樣本量不足而產(chǎn)生偏倚的可能，多中心大樣本的臨床研究對(duì)本研究結(jié)論的驗(yàn)證是必要的。本研究結(jié)果顯示，miR-98-5p可以結(jié)合HMAG2的3′-UTR并抑制HMAG2的表達(dá)，抑制喉鱗癌的發(fā)展。miR-98-5p可能成為喉鱗癌診斷及治療的新靶點(diǎn)，為診斷及治療喉鱗癌提供新的研究價(jià)值和臨床導(dǎo)向。